一种吡咯生物碱蛋白加合物的检测方法及一种试剂盒与流程

本发明属于医学检测，具体涉及一种吡咯生物碱蛋白加合物的检测方法及一种试剂盒。

背景技术：

1、吡咯里西啶生物碱(pyrrolizidine alkaloid，pa)为自然界中广泛分布的一类生物碱成分，具有极强的肝毒性。中草药作为传统药物资源有着数千年的使用历史和文化传承，一直被广泛使用。一些含pa的植物，如菊科的土三七、千里光，豆科的猪屎豆，紫草科的天芥菜等，服用后可能导致严重的肝窦阻塞综合征(hsos)。为此，2017年颁布了《吡咯生物碱相关肝窦阻塞综合征诊断和治疗专家共识意见》共识与指南，该指南推荐意见：hsos以pa-hsos为主，pa-hsos病因以服用土三七最常见；证据等级为a级，推荐强度为1级。在hsos的诊断中，目前主要通过血浆胆红素等生化指标检测和超声、ct、mri等影像学的方法诊断hsos，缺乏直接检测hsos标志物的方法。

2、人体服用含pa的中草药后，pa在体内经过一系列的生物酶转化，最终生成吡咯生物碱蛋白加合物和吡咯生物碱-dna加合物，直接检测这些标志物不仅为hsos病因提供最直接证据，也为今后pa-hsos的体内病理机制研究提供数据基础。关于吡咯生物碱蛋白加合物的检测已有诸多报道，然而，已报道的定量检测方法未使用内标，如maj,zhangw,hey,etal.clinical application ofpyrrole–hemoglobin adducts as a biomarkerofpyrrolizidine alkaloid exposure inhumans[j].archives oftoxicology,2020,95(3):1-7(现有方法1)；或者，尽管使用了内标，但在lc-ms检测前才加入该内标，如xia q,zhaoy,lin g,et al.pyrrolizidine alkaloid-protein adducts-potential non-invasive biomarkers of pyrrolizidine alkaloid-inducedlivertoxicityandexposure[j].chemical research intoxicology,2016:1282-1292(现有方法2)。在进行吡咯生物碱蛋白蛋白加合物检测时的样本配制过程中，需要先通过化学反应将吡咯生物碱蛋白蛋白加合物中的吡咯结构部分释放出来，再进行后续的lc-ms检测分析。该检测过程的样本溶液配制过程复杂，化学反应过程会对定量结果产生很大影响，不加入内标或在lc-ms检测前才加入内标均不能有效校正样本配制误差，导致定量检测的重复性和准确性差。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种吡咯生物碱蛋白加合物的检测方法及一种试剂盒，尤其提供一种精确的吡咯生物碱蛋白加合物的检测方法及一种试剂盒。本发明提供的检测方法具有精密度高、准确度高的优点，内标物不会在样品处理过程中被破坏，能够有效校正整个样本前处理过程。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种吡咯生物碱蛋白加合物的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

4、步骤1样本溶液的配制：将待测样本与蛋白沉淀剂混合，之后离心去除第一上清液，得到残留物，加入内标7,9-di-eto-dhp-d3，之后与释放剂混合，离心，取第二上清液，为待测液；

5、步骤2lc-ms检测：取步骤1处理获得的待测液进lc-ms检测；

6、步骤3数据处理：根据步骤2的检测结果结合内标计算待测血液样本中吡咯生物碱蛋白加合物或吡咯生物碱蛋白加合物中的吡咯生物碱的浓度或含量；

7、其中，所述释放剂用于将吡咯生物碱蛋白加合物中的吡咯结构部分释放出来；

8、所述内标7,9-di-eto-dhp-d3的结构如下所示：

9、式中，d为氘氢。

10、在一些实施方式中，所述释放剂为含硝酸银的乙醇溶液，优选地，步骤1中与释放剂混合在震荡下进行，所述震荡的时间为10-30min，可以是10min、11min、15min、20min、25min或30min等。

11、在一些实施方式中，所述步骤1取第二上清液后还包括：将第二上清液与衍生剂混合，之后离心取上清为待测液；优选地，所述衍生剂为含daba的乙醇溶液；优选地，第二上清液与衍生剂混合在震荡下进行，所述震荡的时间为20-30min，可以是20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min或30min等，所述震荡在温度为55-65℃下进行，可以是55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃等。

12、在一些实施方式中，所示待测样本为血液样本或血细胞样本。

13、在一些实施方式中，所述蛋白沉淀剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、异丙醇中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述蛋白沉淀剂为乙腈。

14、在一些实施方式中，所述待测血液样本与乙腈、含硝酸银的乙醇溶液的体积比为1:(2-4):(1-3)，可以是1:2:1、1:2.5:1.5、1:3:2、1:3.5:2.5或1:4:3等。

15、优选地，含硝酸银的乙醇溶液中硝酸银的质量分数为0.8％-1.2％，可以是0.8％、0.9％、1％、1.1％或1.2％等。

16、优选地，所述内标7,9-di-eto-dhp-d3以含内标7,9-di-eto-dhp-d3的溶液的形式加入，所述含内标7,9-di-eto-dhp-d3的溶液中7,9-di-eto-dhp-d3浓度为5ng/ml～50ng/ml，所述含内标7,9-di-eto-dhp-d3的溶液的加入量与待测血液样本的体积比为(1～5):10，可以是1:10、2:10、1.5:10、5:10等。

17、在一些实施方式中，步骤1所述衍生剂与第二上清液的体积比为(1-2):3，可以是1:3、1.2:3、1.4:3、1.6:3、1.8:3或2:3等。所述含daba的乙醇溶液中daba的浓度为15mg/ml-25mg/ml，可以是15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml或25mg/ml等。

18、优选地，所述含daba的乙醇溶液中还含有质量分数0.8％-1.5％的高氯酸，可以是0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％等浓度的高氯酸。

19、优选地，所述方法还包括：空白样本溶液的配制：将空白样本代替待测样本，进行步骤1的处理过程；所述空白样本为健康人或动物的血浆蛋白溶液。

20、优选地，所述方法还包括：校准品溶液的配制：将校准品代替待测样本，进行步骤1的处理过程；所述校准品为7,9-di-eto-dhp(7,9-di-c2d5o-dhp)或含7,9-di-eto-dhp的溶液。

21、在一些实施方式中，步骤2的所述lc-ms检测的条件包括：进样量为1-10μl，可以是1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl或10μl等。柱温为45-55℃，可以是45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃等。流速为0.55-0.65ml/min，0.55ml/min、0.56ml/min、0.57ml/min、0.58ml/min、0.59ml/min、0.6ml/min、0.61ml/min、0.62ml/min、0.63ml/min、0.64ml/min或0.65ml/min等。

22、优选地，所述lc-ms检测的条件还包括：色谱柱为supelco discovery hs c184.6×75mm，3μm或同等类型的色谱柱。

23、优选地，所述lc-ms检测的条件还包括：流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a为0.1％甲酸水溶液，所述流动相b为0.1％甲酸乙腈溶液。

24、优选地，所述lc-ms检测的条件还包括：采用梯度洗脱，所述梯度洗脱流程包括：第0-0.3min，流动相a的体积分数为55-65％，流动相b的体积分数为35-45％；第0.3-2min，流动相a的体积分数由55-65％匀速变为0-5％，流动相b的体积分数由35-65％匀速变为95-100％；第2-2.5min，流动相a的体积分数为0-5％，流动相b的体积分数为95-100％；第2.5-2.51min，流动相a的体积分数由0-5％匀速变为55-65％，流动相b的体积分数由95-100％匀速变为35-45％；第2.51-3.5min，流动相a的体积分数为55-65％，流动相b的体积分数为35-45％。

25、优选地，所述lc-ms检测的条件还包括：采用mrm模式，设置定量离子对344.2-299.2和341.2-296.2。

26、上述的数值范围均不限于列举的具体示例，在相应数值范围内其他未列举的数值同样适用。

27、第二方面，本发明提供了一种用于吡咯生物碱蛋白加合物检测的试剂盒，所述试剂盒包括内标7,9-di-eto-dhp-d3以及上述检测方法使用的其他一种或多种试剂。可以采用该试剂盒中的试剂按上述检测方法直接进行吡咯生物碱蛋白加合物的检测，这样能够缩短检测时间，结合上述检测方法，能在1h内完成血液样本中吡咯生物碱蛋白加合物检测，因而可应用于临床大批量样本的检测。

28、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

29、本发明提供了一种吡咯生物碱蛋白加合物的检测方法，所选择的特定内标不会在样品处理过程中被破坏且与待测物具有相似特性，能够有效校正整个样本前处理过程以及后续的检测过程，进而能够提高检测方法的精密度和准确性。本发明提供的检测方法能准确定量检测低浓度的吡咯生物碱蛋白加合物，尤其适用于血液样本或血细胞样本中吡咯生物碱蛋白加合物含量较低的情况。