一种基于抗体富集的ARV7质谱检测方法与流程

本发明属于生物医药，涉及一种基于抗体富集的arv7质谱检测方法，具体涉及细胞样品中arv7的mrm测定方法。

背景技术：

1、雄激素受体3(androgen receptor3，ar3或arv7)，它是雄激素受体(androgenreceptor，ar)的变异体，它们在uniprot中的蛋白id分别为：p10275-3和p10275。相较ar全长共有920个氨基酸，arv7仅有644个，其中629-644处的氨基酸序列为arv7独有序列，即ekfrvgnckhlkmtrp。据报道，arv7不能与睾酮等雄激素结合，但它能够自主激活某些基因，并被认为是前列腺癌耐药的原因之一。体内蛋白arv7的含量升高可能是一种耐药机制的信号，在某些情况下，它可能会导致与ar相关的肿瘤变得耐药。因此对arv7的检测可以帮助评估肿瘤的耐药性、预后及治疗效果，并为个体化治疗提供依据。

2、目前市场上测定arv7的方法只有westernblot和elisa法。其中，westernblot需要特异性抗体，能够检测小样品，但灵敏度和准确度有限；elisa具有灵敏度高、通量高等优点，但对样品质量要求较高，不然易受内源性物质的干扰，影响定量的可靠性。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的不足，本发明提供一种准确可靠、灵敏度较高的基于抗体富集的arv7质谱检测方法，即雄激素受体3(androgen receptor3，ar3或者arv7)的mrm靶向检测方法。本发明采用抗体富集样品中arv7蛋白，酶解获得特征肽段，通过定量特征肽段从而定量样品中arv7的含量。在具体实施方案中，本发明可用于细胞中雄激素受体相关蛋白的含量测定。

2、本发明方法通过检测arv7的标志性肽段的含量来代表arv7蛋白的表达量；所述arv7的标志性肽段序列为如seq id no.1所示的kfrvgnckhlkmtrp；其包括以下步骤：

3、(1)样本的收集和蛋白提取；

4、(2)arv7抗体与磁珠的偶联；

5、(3)目的蛋白arv7的抗体富集；

6、(4)目的蛋白还原烷基化和酶解；

7、(5)arv7标志性肽段选定；

8、(6)质谱的mrm方法开发；

9、(7)样本中arv7的mrm检测与数据分析。

10、本发明步骤(1)中，优选地，蛋白提取的裂解液为8m urea。

11、本发明步骤(2)中，优选地，所用的抗体为arv7抗体，所用的磁珠为羧基磁性微球(bioeast mag-cooh，2.8μm)。抗体与磁珠的用量比例为1:50。抗体与磁珠偶联反应的孵育条件以及之后封闭反应的条件都为室温4h。偶联和封闭期间，磁性微球都需保持混悬状态。

12、本发明步骤(3)中，优选地，抗体用量为1μg，富集实验的蛋白抗原起始量为100μg。

13、本发明步骤(4)中，还原试剂为ddt(终浓度为10mm)，反应条件为37℃下55min；烷基化试剂为iam(终浓度为20mm)，反应条件为避光放置15min以上。

14、本发明步骤(4)中，优选地，实验用酶为glu-c(用量为1μg)，酶解缓冲体系为乙酸铵(ph＝5.5)，37℃反应16h。

15、本发明步骤(5)中arv7标志性肽段是指序列为kfrvgnckhlkmtrp(如seq id no.1所示)的轻标内标肽。

16、本发明步骤(6)中质谱的mrm方法开发包括质谱参数的优化和色谱方法的优化。选用的质谱为sciex triple quadtm 7500三重四级杆质谱，液相为岛津lc-30ad。优选地，

17、质谱条件为：去簇电压设为40，q1/q3四级杆设为unit，喷雾电压5500v，帘气35psi，鞘气55psi，辅助加热气55psi，辅助加热气温度550℃，cad:medium。

18、色谱条件为：色谱柱hss t3(2.1×100mm，1.9μm)；流动相a为0.1％甲酸水，流动相b为0.1％甲酸乙腈；色谱流速为0.35ml/min；柱温40℃；洗脱梯度为0-0.2min，0％b；0.2-6.8min，0％b上升至20％b；6.8min-7.0min，20％b上升至80％b；7.0min-8.2min，维持80％b；8.2min-8.3min，80％b恢复至初始0％b；8.3min-10min，维持0％b。

19、本发明步骤(6)中arv7标志性肽段因还原烷基化反应后产生的质量偏移，在质谱检测时，信号优异的m/z为624.670，价态为+3。

20、本发明步骤(1)和(7)中的样本除细胞外，还包括组织和血清等生物样本。

21、本发明步骤(7)所述的arv7的mrm检测对象是指arv7的标志性肽段，所述的表达量是指相对含量或绝对含量。

22、本发明步骤(7)中mrm检测与数据分析是通过比较不同样品中arv7的标志性肽段的mrm特征峰面积，来计算样品中arv7的相对含量。在具体实施方案中，具体地，取相同总蛋白量的样品a和样品b同步进行实验与质谱分析，通过测得各自的arv7的mrm特征峰面积为area_a和area_b，则arv7在样品a和样品b中的相对含量即为area_a/area_b。通过代入已知浓度的轻标肽段峰面积与浓度所绘制的标准曲线线性方程，来计算样品中arv7的绝对含量。具体地，取总蛋白含量为100μg的样品c进行实验与质谱分析，通过测得的arv7的mrm特征峰面积为area_c，带入标准曲线线性方程，得到arv7的浓度为con_c(ng/ml)，经过所有前处理环节后的最终复溶体积为v(μl)，则最终可得到arv7的含量数值为(con_c×v×10-3)ng/100μg蛋白。

23、本发明中，步骤(7)中所述的对arv7的标志性肽段的mrm检测，其中的特征峰面积的计算是通过检测标志性肽段母离子与其产生的子离子碎片组成的母子离子对组合实现的。其中，质谱分析测得的定量子离子的峰面积即可视为特征肽段的峰面积。

24、而标志性肽段的母子离子对组合为：624.67/745.43和624.67/504.25。

25、本发明还提出了一种药效评价方法，其基于如上所述的基于抗体富集的arv7质谱检测方法。

26、本发明还提出一种arv7质谱检测试剂盒/试剂/产品，其用于所述基于抗体富集的arv7质谱检测方法，其包括如seq id no.1所述的arv7标志性肽段序列kfrvgnckhlkmtrp。进一步地，其还包括：蛋白裂解液、还原试剂、烷基化试剂、蛋白内切酶、酶缓冲液等。

27、本发明还提出所述方法、所述药效评价方法、所述arv7质谱检测试剂盒在在定量生物样本中arv7蛋白含量的检测中的应用，在前列腺癌诊断、检测、病程监测以及预后评估中的应用，在评估以arv7为药物靶点开发的protac、小分子抑制剂、药物对arv7蛋白降解量即药效评价中的应用。本发明提供非诊断目的的arv7质谱检测方法及应用、arv7质谱检测试剂盒及其应用。

28、本发明的优点及有益效果包括但不限于：mrm质谱方法和抗体富集纯化目标的有机结合，使得本发明具有特异性强、准确性和可靠性高、以及灵敏度较高的优点；抗体富集显著降低了生物样本中的内源性物质，使得样本对质谱的污染程度低。同时，质谱法检测时间是10min，这大大提高了检测的通量；本发明为定量检测其它低含量的(变体)蛋白提供了一种可借鉴方法。相对于市场现有检测方法，mrm质谱技术具有高度特异性和可靠性高的优点。同时为了克服质谱有限的灵敏度的问题，本发明方法中在前处理环节加入了抗体富集实验，以此提升arv7检测的灵敏度。通过mrm质谱技术和目标蛋白富集纯化的有机结合，来达到该二者对方法建立提供优势互补的目的。本发明采用抗体富集并结合mrm质谱检测方法，对arv7进行相对或绝对定量分析，这填补了arv7在质谱领域的技术空白，本发明具有特异性强、准确性和可靠性高、以及灵敏度较高的特点。