一种细菌种类及抗生素敏感性的一体化质谱检测方法

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及一种细菌种类及抗生素敏感性的一体化质谱检测方法。

背景技术：

1、细菌感染是世界范围内的一个主要健康问题伴随着极高的发病率和死亡率。有文献报道，对于脓毒症病人，每延迟1小时有效的抗生素治疗，患者死亡率增加7.6％。另一方面，由于抗生素的过度使用，耐药菌株出现比例大大增加，制约了临床合理用药。因此，在感染早期实现快速、准确的细菌识别及抗生素敏感性判断对精准治疗至关重要。

2、目前，培养法被认为是细菌鉴定的金标准。纸片扩散试验和最低抑菌浓度试验被认为是临床抗生素敏感性检测的金标准。然而，这些方法需要长时间的培养，不能即时得到检测的结果。为了克服上述方法的局限性，一些基于快速检测的新方法正在开发。如基于聚合酶链反应(pcr)的技术，既可以进行细菌识别，也可以针对已知的耐药基因序列进行耐药检测，而不依赖耗时的培养。然而，复杂的预处理过程在一定程度上限制了它的应用，同时聚合酶链反应只能靶向检测已知核酸序列的细菌，不能检测未知细菌。

3、质谱分析方法是一种非靶向的分析方式。质谱无需知道待检测物质，根据分析物的质荷比检测未知物，通过对比谱图得到检测物质信息。因此，能够对各种未知成分进行快速鉴定，被广泛应用于未知生物样品的分析。目前基质辅助激光解吸电离质谱技术，通过检测蛋白质进行细菌识别，并通过检测抗生素的水解峰进行抗生素耐药性检测。然而基质产生的离子信号可能干扰待检测信号，细菌制备过程复杂，不能同时进行细菌种类和抗生素敏感检测。因此，需要发展一种能够快速同时进行细菌种类及抗生素敏感检测的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种细菌种类及抗生素敏感性的一体化质谱检测方法。针对现存检测方法所存在的不足，本发明首次提出了基于电喷雾质谱的细菌种类及抗生素敏感检测的分析方法，通过抗生素孵育生物样本的方式，对生物样品中细菌的代谢物和抗生素及其水解产物进行质谱检测，实现生物样品中细菌种类和药敏性的同时检测，抗生素孵育和质谱检测过程小于30min，满足在实际生物样品中快速灵敏一体化的细菌分析需求。

2、具体地，本发明提供了以下方面：

3、1.用于检测细菌种类及其药敏性的方法，其包括以下步骤：

4、从样品中提取细菌并培养；

5、向细菌培养液中添加抗生素，使其与细菌共孵育；

6、将共孵育后的细菌培养液进行电喷雾质谱分析，检测与药物共孵育后的所述细菌的代谢物以及所述抗生素及其水解物；

7、其中，通过将所述代谢物的质谱图谱输入细菌种类数据库中而鉴定待测细菌的种类，并通过计算共孵育0min时和共孵育10-120min时抗生素水解物和抗生素信号强度比值的p-value值来判断药敏性。

8、2.根据项目1所述的方法，其中，所述细菌种类数据库的建立方法为将一种或多种已知种类的细菌进行电喷雾质谱分析，并通过t-sne分析将所述已知种类的细菌的代谢物质谱图谱与其种类相对应，从而建立细菌种类的数据库。

9、3.根据项目1所述的方法，其中，通过计算共孵育0min时和共孵育30min时抗生素水解物和抗生素信号强度比值的p-value值来判断药敏性。

10、4.根据项目1-3中任一项所述的方法，其中，在药敏性判断中，当p-value值≥0.05时，判断所述细菌为对所述抗生素敏感的细菌；当p-value值＜0.05时，判断所述细菌为对所述抗生素具有抗性的细菌。

11、5.根据项目1-3中任一项所述的方法，其中，所述样品包括受试者的全血，尿液，唾液，脑脊液，肺泡灌洗液，和细菌感染的任意组织样品；

12、优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人，小鼠，或兔。

13、6.根据项目1-3中任一项所述的方法，其中，所述细菌包括大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，以及细菌感染中的任意菌种。

14、7.根据项目1-3中任一项所述的方法，其中，所述抗生素包括但不限于美罗培南，氨苄西林，头孢氨苄，以及用于治疗细菌感染的任意抗生素。

15、8.根据项目1-3中任一项所述的方法，其中细菌与抗生素共孵育的时间为10-120min；任选地，所述细菌与抗生素共孵育的温度为16-45摄氏度。

16、9.根据项目1-3中任一项所述的方法，其中，在进行电喷雾质谱分析过程中，毛细管开口大小为5-10μm。

17、10.根据项目1-3中任一项所述的方法，其中，在进行电喷雾质谱分析过程中，所施加电压为交流电压或直流电压，电压为2-5kv。

18、更具体地，本发明的方法可包括以下步骤：

19、步骤(1)：从样品中提取细菌，在富含营养的平板培养基中进行培养，提取单个细菌群落；优选地，所述平板培养基可以为血琼脂培养基、巧克力平板培养基、麦康凯琼脂培养基等任意为细菌提供营养物质的固体基质；任选地，所述样品包括受试者的全血，尿样，唾液，脑脊液，肺泡灌洗液，和细菌感染的任意组织样品例如细菌感染的细胞溶液或细菌感染的组织悬液；

20、步骤(2)：将步骤(1)获得的单个细菌群落在具有营养物质的液体培养基中培养；

21、优选地，所述液体培养基可以为肉汤培养基、大肠杆菌培养基、营养液培养基等任意可以为细菌提供营养物质的液体基质；

22、步骤(3)：将步骤(2)中所获得的单个细菌群落的培养液离心并洗涤；

23、优选地，所述离心转速为3000-8000rpm，离心时间为3-10分钟；

24、步骤(4)：将步骤(3)所得细菌样品重悬于水溶液中，使保持细菌活性；

25、步骤(5)：将抗生素添加到步骤(4)的细菌悬液中，与细菌共同孵育一段时间；优选地，所述抗生素的浓度为所选抗生素0.2-10倍(优选1-10倍)的临界抑菌浓度值；其中，所述临界抑菌浓度是指抗生素杀灭细菌的最低浓度；

26、在本步骤中，细菌与抗生素的孵育时间可以是使细菌与抗生素充分反应的任意时间，例如，至少10分钟，至少15分钟，至少20分钟，例如10-60分钟，20-60分钟，30-60分钟，40-60分钟，50-60分钟，10-50分钟，20-50分钟，30-50分钟，40-50分钟，10-40分钟，20-40分钟，30-40分钟，10-30分钟，20-30分钟，10-70分钟，10-80分钟，10-90分钟，10-100分钟，10-110分钟，10-120分钟，20-70分钟，20-80分钟，20-90分钟，20-100分钟，20-110分钟，或20-120分钟。

27、步骤(6)：将步骤(5)所得的与抗生素孵育的细菌悬液直接注入毛细管中；

28、步骤(7)：在步骤(6)中的毛细管中施加电压，通过电喷雾质谱检测溶液中细菌代谢物以及抗生素及其水解物；

29、任选地步骤(8)：细菌数据库的建立；

30、在本步骤中，所述细菌种类数据库可以是在检测之前预先已建立的数据库，或者也可以在检测过程中进行建库；

31、数据库的建立方法为将一种或多种已知种类的细菌进行电喷雾质谱分析，并通过t-sne分析将所述已知种类的细菌的代谢物质谱图谱与其种类相对应(例如进行模型训练，所述模型为常规的统计学模型)，从而建立细菌种类的数据库；

32、其中，所述t-sne分析又称t分布式随机邻居嵌入，是生信分析中的非常常用的数据分析算法。

33、步骤(9)：例如通过t-sne分析将所述代谢物的质谱图谱输入细菌种类数据库中而鉴定所述细菌的种类；

34、步骤(10)：根据所述通过计算孵育0min和孵育10-120min时抗生素水解物和抗生素信号强度的比值的p-value值来判断所述细菌的药敏性；

35、在本步骤中，细菌与抗生素的孵育时间可以是使细菌与抗生素充分反应的任意时间，例如至少10分钟，至少15分钟，或至少20分钟，例如10-60分钟，20-60分钟，30-60分钟，40-60分钟，50-60分钟，10-50分钟，20-50分钟，30-50分钟，40-50分钟，10-40分钟，20-40分钟，30-40分钟，10-30分钟，20-30分钟，10-70分钟，10-80分钟，10-90分钟，10-100分钟，10-110分钟，10-120分钟，20-70分钟，20-80分钟，20-90分钟，20-100分钟，20-110分钟，或20-120分钟。

36、在本发明中，所述电喷雾质谱(electrospray ionization mass spectrometry,esi-ms)是一种常用的质谱分析技术，其原理是将待分析样品通过高压电场形成喷雾，然后在气体中形成离子，将离子传输到质谱仪中进行分析。在喷雾的过程中，待分析的样品被注入到带有高电压的枕头上，形成高强度的电场。随着电场的增强，液滴在针尖处被雾化成更小的液滴，直到形成亚微米级别的小液滴。这些小液滴在高压电场的作用下逐渐带电，并且在空气中蒸发，留下了带电荷的气态分子离子。这些离子被输送到质谱仪中进行分析，质谱仪会测量它们的质荷比(m/z)值，并生成对应的质谱图谱。

37、在本发明的具体实施方案中，所使用的示例性电喷雾质谱为exactive plus massspectromete。

38、在本发明中可用的抗生素包括但不限于：氨基糖类，例如庆大霉素、卡那霉素、新霉素、巴龙霉素、链霉素或妥布霉素；桥环类抗菌素，如利福霉素或利福平；头孢菌素，如先锋菌素ⅳ、先锋霉素ⅱ、先锋霉素ⅰ、defazolin、头孢匹林、头孢雷定或先锋霉素ⅲ；氯霉素；大环内酯族，如红霉素、太乐菌素、竹桃霉素或螺旋霉素；青霉素类，例如青霉素g和v、青霉素b、甲氧苯青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、氟氯青霉素、乙氧萘青霉素、氨苄青霉素、美罗培南、羟氨苄青霉素或羧苄青霉素；磺胺类；四环素类，如四环素、土霉素、金震素、甲烯土霉素、去甲金霉素、吡甲四环素、强力霉素或二甲胺四环素；甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑；多肽，例如杆菌肽、多粘菌素、短杆菌素或万古霉素；还有其他抗生素，例如洁霉素、氯洁霉素或放线壮观素。

39、本发明具有以下效益：

40、(1)速度快，相较于传统的需要16-24h基于细菌培养的细菌种类鉴定和抗生素敏感检测的方法，该方法总共只需要10min的时间，即可根据抗生素水解物和抗生素信号的比值判断药敏性，以及从质谱图得到的标志性代谢物进行细菌种类鉴定，从而指导用药。

41、(2)灵敏度高，相较于其他需要高浓度细菌才能检测细菌种类或抗生素敏感检测方法，该方法能够检测的细菌浓度满足临床检测需求，对于某些生物样本无需培养即可进行检测，有助于快速的到检测结果。

42、(3)一体化，一次检测能够同时得到细菌种类鉴定和抗生素敏感检测的结果，无需做两次实验，分别得到细菌种类鉴定的结果和抗生素敏感检测的结果，省时省力。