夹心法检测样本中目标分子的方法与流程

本发明涉及体外检测，具体涉及夹心法检测样本中目标分子的方法。

背景技术：

1、血液或血清样本中一些小分子通常以结合态的形式存在(例如小分子物质会与一些结合蛋白相结合形成复合物)，这导致临床检测时一些结合态的小分子并未检出，从而影响了临床上对小分子检测的准确性。例如，fa(叶酸)通常以结合态的形式存在于人体中，已发现的叶酸结合蛋白有三类：高亲和力叶酸结合蛋白(可溶性的frs存在于血液中)、与膜有关的结合蛋白和细胞质结合蛋白。高亲和力叶酸结合蛋白(frs)保护了叶酸在血液中的稳定存在，还可能控制了血浆中叶酸盐分布的专一性。

2、血清样本中小分子有机物的分析方法主要有：液相质谱(lc-ms)和气相质谱(gc-ms)。上述方法虽然灵敏度高，但同时也需要较高的专业技能，且耗费大量人力物力，不适合基层使用；最关键的一点为结果分析周期长。临床检测通常采用化学发光与免疫学相结合的方法，由于这类小分子表位较小，难以通过常规的双抗体夹心法进行检测。

3、竞争法为小分子检测的主要方法学，但竞争法相比夹心法存在以下缺陷：①灵敏度欠佳，低值样本检出率或重复性欠佳；②准确性不足，天然小分子和小分子类似物与抗体结合亲合力可能存在差异，影响准确度。

4、因此亟需开发一种能够准确、低成本地检测血液或血清样本中小分子物质的方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种待测样本中目标分子的检测方法，主要通过夹心法检测，极大提高了血清中小分子检测的准确性。本发明方法利用特异性结合目标分子-目标分子结合蛋白的复合物抗体，形成目标分子-目标分子结合蛋白-抗体三元复合物进行检测。检测含有目标分子-目标分子结合蛋白的生物样品时，本发明方法首先利用特定的反应体系处理待测样本，以将待测样本中的目标分子-目标分子结合蛋白复合物中的目标分子解离出来，这样能够进一步提升目标分子检测的准确度。

2、为此，本发明第一方面提供一种待测样本中目标分子的检测方法。根据本发明的实施方案，所述检测方法包括：

3、s1：提供含有目标分子结合蛋白的检测试剂和含有抗体的检测试剂，所述目标分子结合蛋白能够与待测样本中的目标分子结合形成目标分子-目标分子结合蛋白复合物，且所述复合物中目标分子诱导结合蛋白形成至少一个新的构象表位，所述抗体能够特异性结合所述至少一个新的构象表位；

4、s2：使得待测样本与含有所述目标分子结合蛋白的检测试剂和含有抗体的检测试剂接触，以获得目标分子-目标分子结合蛋白-抗体的复合物；

5、s3：通过检测s2获得的所述目标分子-目标分子结合蛋白-抗体的复合物，用于检测样本中含有的目标分子。

6、本发明方法主要通过利用特异性结合目标分子-目标分子结合蛋白的复合物抗体，形成目标分子-目标分子结合蛋白-抗体三元复合物进行检测，以便提升目标分子检测的准确度。

7、根据本发明的实施方案，所述目标分子结合蛋白不为抗体。

8、根据本发明的实施方案，所述待测样本包括选自校准品、质控品、标准品、血清样本、血浆样本中的任一种。

9、根据本发明的实施方案，当待测样本中含有目标分子-目标分子结合蛋白复合物时，所述检测方法进一步包括，在s2之前，利用解离液处理待测样本，以便将待测样本中的目标分子-目标分子结合蛋白复合物中的目标分子解离出来。

10、根据本发明的实施方案，所述解离液包括ph为12-14的碱性试剂以及还原剂。

11、通过提供碱性环境，使得血液中的目标分子结合蛋白(例如fa结合蛋白fabp)发生变性，二硫键打开生成巯基。再通过进一步添加还原剂，进一步使得二硫键被还原，而导致目标分子结合蛋白失去结合目标分子的能力，从而获得游离目标小分子。

12、根据本发明的实施方案，所述碱性试剂包括naoh、koh中的至少之一。

13、根据本发明的实施方案，所述还原剂包括选自dtt、tcep、bme、dte中的至少之一。

14、根据本发明的实施方案，所述还原剂为dtt。

15、根据本发明的实施方案，步骤s2进一步包括：

16、向经所述解离液处理的待测样本中加入所述含有抗体的检测试剂及含有所述目标分子结合蛋白的检测试剂，获得反应体系1，

17、其中，所述含有抗体的检测试剂的加入量保证所述反应体系1的ph为7-10且使得经解离后样本中的目标分子不与所述待测样本中含有的目标分子结合蛋白结合，而与检测试剂中的目标分子结合蛋白结合。

18、向经所述解离液处理的待测样本中加入所述含有抗体的检测试剂，一方面能够中和解离液的强碱环境，解离液被进一步稀释，此时解离液无法发挥将目标分子-目标分子结合蛋白解离的作用，不会对下一步形成三元复合物有影响；另一方面，也能够保证含有抗体的检测试剂在进行检测时不受影响(例如一些信号生成物在强碱环境下发光信号会受到影响)。

19、根据本发明的实施方案，所述含有抗体的检测试剂的ph为5-7。

20、根据本发明的实施方案，含有所述目标分子结合蛋白的检测试剂的ph为4-10。

21、根据本发明的实施方案，所述含有目标分子结合蛋白的检测试剂包括包被目标分子结合蛋白的载体。

22、根据本发明的实施方案，所述载体包括磁珠、微球中的任一种。

23、根据本发明的实施方案，所述含有抗体的检测试剂包括与所述抗体相连的信号生成物。

24、根据本发明的实施方案，所述信号生成物包括非酶促发光化合物和/或酶促化学发光化合物。

25、根据本发明的实施方案，所述信号生成物包括选自abei、吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺、ahei、itci、光泽精、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶的至少之一。

26、根据本发明的实施方案，所述信号生成物为abei。

27、本发明第二方面提供一种目标分子检测试剂盒。根据本发明的实施方案，所述目标分子检测试剂盒包括：

28、1)含有目标分子结合蛋白的检测试剂；

29、2)含有抗体的检测试剂；

30、其中，所述抗体为能够与目标分子-目标分子结合蛋白复合物特异性结合，但与游离的目标分子或目标分子结合蛋白不结合的抗体，

31、所述含有抗体的检测试剂包括与所述抗体相连的信号生成物。

32、根据本发明的实施方案，所述含有目标分子结合蛋白的检测试剂包括包被目标分子结合蛋白的载体。

33、根据本发明的实施方案，所述载体包括磁珠、微球中的任一种。

34、根据本发明的实施方案，所述信号生成物包括非酶促发光化合物和/或酶促化学发光化合物。

35、根据本发明的实施方案，所述信号生成物包括选自abei、吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺、ahei、itci、光泽精、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶的至少之一。

36、根据本发明的实施方案，所述信号生成物为abei。

37、根据本发明的实施方案，所述含有目标分子结合蛋白的检测试剂的ph为4-10。

38、根据本发明的实施方案，所述含有抗体的检测试剂的ph为5-7。

39、本发明第三方面提供一种血液样本中目标分子检测试剂盒。根据本发明的实施方案，所述试剂盒包括第二方面所述的试剂盒中的试剂，以及

40、解离液，

41、其中，所述解离液用于将所述血液样本中的目标分子-目标分子结合蛋白复合物中的目标分子解离出来，

42、所述解离液包括ph为12-14的碱性试剂以及还原剂。

43、根据本发明的实施方案，所述碱性试剂包括naoh、koh中的至少之一。

44、根据本发明的实施方案，所述还原剂包括选自dtt、tcep、bme、dte中的至少之一。

45、根据本发明的实施方案，所述还原剂为dtt。

46、本发明第四方面提供第二方面所述的目标分子检测试剂盒、第三方面所述的血液样本中目标分子检测试剂盒在利用化学发光法对待测样本中的目标分子进行检测中的用途。

47、本发明提供的待测样本中目标分子的检测方法，利用特异性结合目标分子(如fa)-目标分子结合蛋白(如fabp)的复合物抗体，能够实现目标分子的线性检测。且通过调节反应体系，能够在测试样本时，提高样本检测结果与质谱检测结果一致性。

48、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。