一种高效液相色谱法测定4种维生素B12含量的方法与流程

本发明属于化学分析领域，具体涉及一种高效液相色谱法同时测定4种维生素b12含量的方法。

背景技术：

1、维生素b12又称为钴胺素，通常指具有相同生物活性的钴胺素族，也是唯一含有金属元素的水溶性维生素，是人体必需的微量营养成分之一。若摄取不足，则可能引起恶性贫血，骨髓变性，舌炎，神经系症状，四肢僵硬，易受刺激，困倦，精神不振等。其分子结构是以钴离子为中心的咕啉环和5,6-二甲基苯并咪唑为碱基组成的核苷酸，它的家族成员主要包括：氰钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺与甲钴胺。该结构式如下：

2、

3、维生素b12类化合物对光极不稳定，结晶性原料药及其溶液遇强光或紫外线易被破坏。目前维生素b12测定方法已有微生物分析法、分光光度法和色谱法。微生物法和分光光度法专属性差，容易受样品基质的影响，测定结果不精确。现有色谱法检测过程中需要在暗室环境下避光操作，先利用氰化物使样品中的羟钴胺、甲钴胺和腺苷钴胺与氰化钾(或氰化钠)反应转化为氰钴胺，再通过测定氰钴胺的含量反应维生素b12总体的含量水平。该方法样品前处理需要在暗室环境下衍生化操作，且溶液不稳定，存在操作复杂、费时费力、对人员技术要求高、检测结果不准确等问题。

4、因此，需要开发建立一种高效液相色谱法同时测定4种维生素b12的含量，并且通过加入光稳定剂的方式增加供试品溶液稳定性，来提高分析效率和准确性。

技术实现思路

1、本发明的目的是建立一种高效液相色谱法同时测定4种维生素b12含量的方法，通过加入光稳定剂来提高供试品溶液制备和分析过程中的稳定性，实现对羟钴胺、甲钴胺、氰钴胺和腺苷钴胺含量的有效检出。

2、本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

3、一种高效液相色谱法同时测定4种维生素b12含量的方法，它包括如下步骤：

4、a)样品制备：

5、供试品溶液：避光操作，取适量待测样品约1.3g(约相当于氰钴胺、羟钴胺、甲钴胺与腺苷钴胺各约10mg)，精密称定，置50ml量瓶中，加入2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮100mg，加水超声5min使溶解，用水稀释至刻度，混匀，即得。

6、对照品溶液：避光操作，取氰钴胺、羟钴胺、甲钴胺与腺苷钴胺对照品各约10mg，精密称定，置同一50ml量瓶中，加入2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮100mg，加水超声5min使溶解，用水稀释至刻度，混匀，即得。

7、b)色谱条件：

8、以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/l磷酸盐溶液与乙腈梯度洗脱；流速为0.8～1.2ml/min；柱温25～35℃；检测波长为250～270nm；进样体积10～100μl。

9、所述高效液相色谱法的检测器为紫外检测器，检测波长为260nm。

10、所述流动相a为0.05mol/l磷酸二氢钾溶液，流动相b为乙腈。按下表进行线性梯度洗脱：

11、

12、所述柱温为30℃；

13、所述流速为0.8ml/min；

14、该方法可用于同时测定样品中氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺与腺苷钴胺的含量。

15、本发明产生的有益效果：

16、本发明建立了一种高效液相色谱法同时测定4种维生素b12的含量，具有操作简便、分离效率高、分析速度快、准确度高的优点。

技术特征：

1.一种高效液相色谱法同时测定4种维生素b12含量的方法，其特征在于：将待测样品与光稳定剂加入水中溶解并稀释至刻度，过滤，取续滤液获得供试品溶液，采用高效液相色谱法进行定量检测，确定供试品溶液中维生素b12类物质的含量。其液相色谱条件为：

2.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法同时测定4种维生素b12含量的方法，其特征在于：所述光稳定剂包括水杨酸酯类、二苯甲酮类、苯并三唑类、取代丙烯腈类、三嗪类等有机化合物，优选2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮。

3.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法同时测定4种维生素b12含量的方法，其特征在于：

4.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法同时测定4种维生素b12含量的方法，其特征在于：

5.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法同时测定4种维生素b12含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本发明公开一种高效液相色谱法同时测定4种维生素B<subgt;12</subgt;含量的方法。所述的检测方法包括：使用含光稳定剂的溶剂溶解待测样品，再采用高效液相色谱法进行定量分析，其色谱条件：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相为磷酸盐溶液和乙腈，梯度洗脱；柱温为25～35℃；流速为0.8～1.2ml/min；检测波长为250～270nm；进样量10～50μl。本发明选择高效液相色谱法，采用普适性强的十八烷基硅烷键合硅胶柱对4种维生素B<subgt;12</subgt;含量的测定，解决了供试品溶液光不稳定的问题，用一个方法即可同时测定羟钴胺、氰钴胺、甲钴胺与腺苷钴胺的含量，具有操作简便、效率高、通用性强、准确度高等优点。

技术研发人员：关文捷,孙英英,肖文花,殷浩,刘恩桂,徐志明
受保护的技术使用者：广州远跖恒创医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/5