一种板栗叶片气孔观察样品固定前快速去除叶背茸毛的方法

本申请属于农业，具体涉及一种板栗叶片气孔观察样品固定前快速去除叶背茸毛的方法。

背景技术：

1、叶片是植物进行光合、呼吸和蒸腾作用的重要器官，叶片气孔是植物体内的一个重要结构，它们位于叶片表皮细胞之间，由两个肾形的保卫细胞围合而成，是植物与外界环境进行co2、水汽、o2等物质交换的主要通道。叶片会通过调节气孔大小、密度和开度等特征来优化对co2、水汽等的交换效率，使植物感应和适应环境变化，维持体内的水分平衡和光合作用的进行，以此达到最佳生长状态。因此，气孔特征与植物叶片生理功能密切相关，在植物逆境生理、种质资源评价，以及栽培技术调控等研究中是一项非常重要研究指标。

2、板栗(castanea mollissima bl.)叶片气孔只在下表皮(叶片背面)分布，但是板栗叶片背面具有较密的白色星状茸毛，每1根主茸毛上又有2～8根茸毛分枝，每一分枝茸毛又有一定的长度和粗度，其在叶背相互压叠，使得茸毛层密且厚实，导致板栗叶片背面的气孔几乎被完全遮盖，因此，在观察板栗叶片气孔前，其样品固定前必须把叶背茸毛去除才能进行观察。现有技术中的板栗叶片气孔观察样品去除叶背茸毛的方法主要是橡皮擦拭法，但是该方法需要把叶片采摘下来垫在平板上用上较大力度反复擦拭才能将茸毛去除，耗时长、不能在活体叶片上进行操作，而且98％以上的叶片气孔保卫细胞会被擦烂，所以用此法去除茸毛后的叶片经固定及制片后仅能用于统计气孔密度和大小，但是无法观察到气孔在自然状态下的原有形态(气孔器保卫细胞表面蜡质层厚度及覆盖特征等)、开闭状态，及开度变化规律等特征，即现有技术均无法实现在去除板栗叶片茸毛的同时，还能保持叶片气孔原有适时状态。通过查新检索发现，关于去除板栗叶片茸毛且能使叶片气孔保持原有适时状态的方法尚未见报道。因此，需要找一种能够简单快捷、可以在活体叶片上进行操作，而且不会破坏气孔原有形态的方法来去除板栗叶片气孔观察样品的叶背茸毛，以便之后经固定、制片等处理后使用显微镜对板栗叶片气孔进行观察。

3、申请内容

4、本发明的目的在于提供一种快速去除板栗叶片气孔观察样品的叶背茸毛的方法，该方法能够解决现有技术中板栗叶片气孔观察样品去除叶背茸毛时耗时长、不可在田间活体叶片上处理和破坏气孔原有形态的问题。

5、本发明提供一种板栗叶片气孔观察样品前处理中快速去除叶背茸毛的方法，包括以下步骤：

6、(1)选择活体板栗植株，并选定所需板栗叶片，首先使用浓度为50％酒精均匀喷洒叶片正反面，直至有液滴自叶片正反面滴落，20min后用吸水纸轻轻吸干叶片正反面；

7、(2)用手抓住所述步骤(1)处理后的叶片，用手指轻弹叶片4～5下；选定叶片气孔拟观察部位，用记号笔画出圆圈将其圈住；

8、(3)在活体植株上将所述步骤(2)已选定气孔拟观察部位的叶片背面朝上，用手指垫在叶片气孔拟观察部位下面30s后，另一只手将海绵砂纸条竖向两边同时捏住使海绵砂纸条的表面有个弧面突出，所述弧面的弧度4.2±0.3r，在拟观察部位以5±1mm距离水平来回轻轻打磨6～8次，然后使用海绵砂纸的海绵面擦净凋落的茸毛；

9、(4)将提前准备好的固定液装在离心管里，使用刀片在所述步骤(3)去除茸毛后的气孔拟观察部位徒手切取长宽各5～8mm的叶片小块，用镊子将叶片小块在缓冲液中快速漂洗后置于固定液中浸泡固定，以迅速防止叶片细胞死亡后的变化，防止自溶、腐败，使细胞保持原有形态、结构；

10、(5)将所述步骤(4)处理后的叶片小块带回实验室，室温下固定24小时，即可使用。

11、进一步的，所述步骤(1)中，所述活体板栗植株为健康生长、无病虫害的板栗植株；所述板栗叶片为树冠外围中部无病虫害、完整无损的营养枝自上而下第2-5节位的叶片。

12、进一步的，所述步骤(2)中，所述气孔拟观察部位为叶片背面中部两叶脉间，距离主脉1～3厘米的叶片区域。

13、进一步的，所述步骤(3)中，所述海绵砂纸条目数为400～600目，大小为20×80mm；

14、进一步的，所述步骤(3)中，所述轻轻打磨具体含义为将海绵砂纸面与叶片茸毛接触移动即可，不需施压移动。

15、进一步的，所述步骤(4)中，所述缓冲液为0.2m磷酸缓冲液，其ph值为7.4。

16、进一步的，所述步骤(4)中的固定液为市面上常用的固定液，即电镜固定液。

17、本发明提供了上述方法在板栗叶片气孔观察样品固定前去除茸毛中的应用。

18、本发明还提供了上述方法在板栗种质资源评价、光合特性和抗逆性研究中的应用。

19、本发明还提供了上述方法在观察板栗叶片气孔密度、气孔长度、气孔宽度、气孔腔长度、气孔腔宽度、气孔腔深度、气孔外拱盖层数、气孔外拱盖内缘特征、气孔表面角质层蜡质有无、气孔表面角质层蜡质纹饰特征、气孔腔口角质层蜡质有无、气孔开合状态中的应用。

20、本发明方法适用的板栗为所有已知的板栗品种。

21、本申请的有益效果在于：

22、(1)本申请的方法板栗叶片气孔观察样品的叶背茸毛去除效果较好，可以让气孔完全外露以便观察。不会破坏样品的气孔原有形态，样品经后期常规固定、制片等处理后可以观察叶片气孔开闭状态、表面蜡质层覆盖状态等原有特征。

23、(2)本申请的方法气孔破坏率(2.01％)极显著低于常规橡皮擦拭法(99.56％)，且可在活体叶片上进行操作，不用将叶片采摘下来，对树体损伤较小。

24、(3)本发明的方法去除每个叶片茸毛的耗时极显著低于常规橡皮擦拭法，说明本发明的方法相较橡皮擦拭法更简单快捷，更适合应用于板栗光合特性、抗逆性研究等试验中大量样品的前处理，或应用于在一定时间内大量取样操作。

25、(4)与常规橡皮擦拭法对比得出，本发明的方法在去除叶片茸毛的同时，最大程度保护住气孔保卫细胞，尤其是表面的蜡质层和开闭状态不被破坏，可有效应用于观察气孔的开合状态，及蜡质层结构等12项指标特征。

26、(5)本发明经过长期的探索和大量的试验，得出了板栗叶片的去除茸毛效果的影响因素，主要是酒精处理步骤，以及砂纸打磨时间及弧度。数据可知本发明的步骤具有相辅相成的作用，尤其省略酒精处理步骤后，其打磨耗时时间较长，且气孔外露率显著下降，气孔破坏率也增大。此外，砂纸面弧面突出弧度，打磨次数，酒精度数和处理时间也起到了至关重要的作用。

技术实现思路

技术特征：

1.一种板栗叶片气孔观察样品固定前快速去除叶背茸毛的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的一种板栗叶片气孔观察样品固定前快速去除叶背茸毛的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述活体板栗植株为健康生长、无病虫害的板栗植株；所述板栗叶片为树冠外围中部无病虫害、完整无损的营养枝自上而下第2-5节位的叶片。

3.如权利要求1所述的一种板栗叶片气孔观察样品固定前快速去除叶背茸毛的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述气孔拟观察部位为叶片背面中部两叶脉间，距离主脉1～3厘米的叶片区域。

4.如权利要求1所述的一种板栗叶片气孔观察样品固定前快速去除叶背茸毛的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述海绵砂纸条目数为400～600目，大小为20×80mm。

5.如权利要求1所述的一种板栗叶片气孔观察样品固定前快速去除叶背茸毛的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述轻轻打磨具体含义为将海绵砂纸面与叶片茸毛接触移动即可，不需施压移动。

6.如权利要求1所述的一种板栗叶片气孔观察样品固定前快速去除叶背茸毛的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述缓冲液为0.2m磷酸缓冲液，其ph值为7.4。

7.如权利要求1所述的一种板栗叶片气孔观察样品固定前快速去除叶背茸毛的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，酒精处理20min。

8.如权利要求1所述的一种板栗叶片气孔观察样品固定前快速去除叶背茸毛的方法在板栗种质资源评价、光合特性和抗逆性研究中的应用。

9.如权利要求1所述的一种板栗叶片气孔观察样品固定前快速去除叶背茸毛的方法在板栗叶片气孔观察样品固定前去除茸毛中的应用。

10.如权利要求1所述的一种板栗叶片气孔观察样品固定前快速去除叶背茸毛的方法的如下任意方面的应用，其特征在于，具体在观察板栗叶片气孔密度、气孔长度、气孔宽度、气孔腔长度、气孔腔宽度、气孔腔深度、气孔外拱盖层数、气孔外拱盖内缘特征、气孔表面角质层蜡质有无、气孔表面角质层蜡质纹饰特征、气孔腔口角质层蜡质有无、气孔开合状态中的应用。

技术总结
本发明涉及农业技术领域，具体涉及一种板栗叶片气孔观察样品固定前快速去除叶背茸毛的方法。采用本发明的方法能够解决现有技术中板栗叶片气孔观察样品去除叶背茸毛时耗时长、不可在田间活体叶片上处理和破坏气孔原有形态的问题，具体的，板栗叶片气孔观察样品的叶背茸毛去除效果较好，可以让气孔完全外露以便观察，不会破坏样品的气孔原有形态，样品经后期常规固定、制片等处理后可以观察叶片气孔开闭状态、表面蜡质层覆盖状态等原有特征。

技术研发人员：郭燕,王广鹏,张树航,李颖,张馨方,刘金雨,范丽颖
受保护的技术使用者：河北省农林科学院昌黎果树研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31