来源于鸡的生物标志物POSTN及其筛选方法和应用

本发明属于生物，涉及能够反应鸡应激状态的生物标志物，具体为来源于鸡的生物标志物postn及其筛选方法和应用。

背景技术：

1、家禽是具有热中性区(thermal neutral zone，tnz)的恒温动物。由于体表多被毛、缺乏汗腺，使得家禽对高温非常敏感。当环境温度超过tnz的上限时，家禽则出现热应激，这严重危害家禽健康，导致家禽生产性能下降，甚至是广泛性猝死。比如，3-8周龄aa肉鸡在29.4-40.6℃和40.6℃以上温度下的死亡率分别高达50％和87％，给肉鸡养殖造成巨大经济损失。受热带、亚热带湿热气候影响，我国南方地区养殖的肉鸡更是普遍遭受热应激。寻找能够指示家禽热应激状态的生物标志物来判断家禽的热应激水平并指导生物育种、抗热应激药物研发已经成为避免或减轻家禽热应激的途径之一。

2、目前，生产中最常用的热应激诊断生物标志物包括血清肌酸激酶(同工酶)、乳酸脱氢酶、热休克蛋白、皮质酮、甲状腺激素等。然而，上述生物标志物并不是特异性针对热应激动物的，其他病理过程也会影响这些生物标志物的表达，比如血清肌酸激酶(同工酶)和乳酸脱氢酶分别会在心肌梗死、肝脏损伤时升高。此外，许多生物标志物需要对动物进行剖杀并对特定组织细胞进行检测来确定是否发生了热应激，比如检测心肌组织热休克蛋白的表达以确定其是否发生热应激性猝死。这在实际生产实践中进行临床应用和推广面临着巨大限制，特别是在确定尚未死亡的家禽热应激程度领域。因此，寻找家禽中更特异、更便于活体检测的热应激生物标志物是具有重要意义的。

3、通常，血清学检测是实现活体检测最适宜的方法之一，特别是基于血清蛋白指标开发的elisa检测技术，具有可操作性强、样本量少、快速灵敏的突出特点。随着蛋白质组学的快速发展，基于质谱(mass spectrum，ms)的蛋白质组学技术已成为医学领域用于研究差异表达蛋白的最新技术。无标记定量蛋白质组学技术对蛋白质检测具有良好的灵敏度，是仅用少量总蛋白提取物获得高质量蛋白质组学定量分析的有效方法。所以，利用蛋白质组学技术对热应激鸡血清中各种蛋白质的水平进行定量分析，找出相对特异的、变化显著的蛋白质类型，来作为潜在的热应激生物标志物，是有效和可行的。

技术实现思路

1、解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，在畜禽养殖过程中，能够实时监测畜禽的热应激状态，无需进行解剖，且具有良好的特异性和灵敏度；另外，实时监测畜禽自身是否能够缓解热应激损伤或抗猝死能力；鉴于此，本发明提供了来源于鸡的生物标志物postn及其筛选方法和应用。

2、技术方案：来源于鸡的生物标志物postn，所述生物标志物为来源于鸡血清的骨膜蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示：

3、mkifllftfstfflsafeqaaasahydkilthsrirardqgpnvcalqqvmgtkkkyfstc

4、rnwyqgsicgkkatvlyeccpgymkmdgmrgcpavapidhvygtlgivgatstqqysd

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16、优选的，所述生物标志物合成、分泌自鸡肝细胞，分泌水平随热应激时间的延长而逐渐升高，热应激4小时时达到分泌高峰。

17、优选的，所述生物标志物分布于细胞质、细胞外基质和细胞核。

18、以上任一所述来源于鸡的生物标志物postn的筛选方法，所述方法包括以下步骤：

19、s1、将鸡分为对照组和热应激处理组，热应激处理条件为温度42±1℃、相对湿度65％、5h，处理后采集对照组、存活及死亡的鸡的血液、分离肝组织；

20、s2、从鸡胚中分离得到鸡原代肝细胞，在eagle培养基中培养至细胞融合率达到90％后，在不同的热应激时间条件下培养，结束后收集细胞培养上清液；其中，eagle培养基为84％高糖培养基，15％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素链霉素。

21、s3、从s1采集的血样中分离血清，将3个血清样本混合至一个管中，进行无标记定量蛋白质组学检测，筛选差异表达蛋白；

22、s4、对s3中得到的血清进行蛋白质提取和消化，得到多肽，通过纳米液相色谱质谱法对多肽进行分离和质谱分析，以得到在热应激条件下明显变化的蛋白质用于后续的实验；

23、s5、将s4中扫描得到的原始ms文件使用蛋白质组发现者软件进行处理和分析，筛选显著上调蛋白和显著下调蛋白；

24、s6、对s5中获得的蛋白进行生物信息学分析，包括预测亚细胞定位和对差异表达蛋白进行go富集分析和信号通路分析；

25、s7、使用proc包对每个血清蛋白的浓度进行roc分析，以判断筛选出的蛋白的诊断价值；

26、s8、将固定的肝组织用石蜡包埋并切片，经过处理后在光学显微镜下分析并拍照。

27、以上任一所述来源于鸡的生物标志物postn在制备畜禽热应激状态检测试剂盒中的应用。

28、优选的，所述应激状态包括：畜禽是否发生热应激、热应激损伤加重、具有热应激猝死风险。

29、优选的，所述试剂盒用于实时监测畜禽养殖过程中的热应激状态。

30、以上任一所述来源于鸡的生物标志物postn在制备指示畜禽具有缓解热应激损伤或抵抗猝死能力的试剂盒中的应用。

31、以上任一所述来源于鸡的生物标志物postn在畜禽抗逆生物育种中的应用。

32、以上任一所述来源于鸡的生物标志物postn在制备畜禽抗应激药物中的应用。

33、本发明所述生物标志物骨膜蛋白作用的原理在于：基于热应激对鸡的影响，我们更加关注生物过程的变化。因此，我们进一步分析了富集的bp项。如图4a所示，在hsdvs.con的前10个bp项中，19个上调蛋白和19个下调蛋白成功富集。在hss vs.con中，8个上调蛋白与13个下调蛋白在前10个bp项中成功富集(图4b)。基于富集分析的结果，我们更关注上调蛋白的表达。postn是hss vs.con的前3种最显著上调的蛋白质之一。这些上调的蛋白与诊断指标的关系更为密切，并有可能成为检测热应激的生物标志物。在这里，我们选择了上调最显著的蛋白之一—postn，作为hss vs.con的候选生物标志物。

34、有益效果：(1)本发明所述生物标志物能够针对活体鸡进行实时监测，判断其是否处于热应激状态、热应激水平、是否具有热应激猝死风险，避免了必须解剖动物才能测定其遭受热应激与否的弊端；(2)所述标志物能够实时指示畜禽是否具有缓解热应激损伤或抵抗猝死的能力；(3)所述标志物具有良好的特异性和灵敏度；(4)所述生物标志物在应激检测试剂盒开发、抗逆生物育种和抗应激药物研发中具有重要作用。