用于时间分辨荧光微球抗体标记物的喷膜保护液及其应用的制作方法

本发明涉及医学免疫诊断，特别是涉及一种用于时间分辨荧光微球抗体标记物的喷膜保护液及其应用。

背景技术：

1、时间分辨荧光免疫分析法是上世纪70年代由芬兰的soini和hemmia提出的一种新型的检测手段，与化学发光、电化学发光免疫检测技术并称为三大超灵敏检测技术，在食品检测、医学临床检测、环境检测以及生物学科研检测等方面广泛应用。

2、基于时间分辨荧光纳米微球的免疫层析快速定量检测技术，因其具有灵敏度高、定量范围宽、准确度和精密度高、样本适应性强、操作快速简便等优点，被业界誉为第四代荧光定量免疫层析技术中“皇冠上的明珠”，正快速替代胶体金和酶联免疫等传统快速检测产品，引领快速检测从粗略定性到准确定量的升级换代。

3、时间分辨荧光微球抗体标记物是最核心的组分，其喷涂于结合垫上的工艺好坏将对产品的准确度、精确度、稳定性和抗破坏性产生直接的影响，而这其中，时间分辨荧光微球抗体标记物的喷膜保护液所采用的配方非常关键。不适合的保护液配方可能会产生以下问题：①无法很好的将微球进行非常均匀的分散，导致测定结果精密度差；②干燥后释放不均匀、不干净，导致基线不平，测定结果的准确度和精密度均差；③对不同样品基质的抗干扰能力差，导致基质效应明显，样品适用范围窄；④保护能力差，时间分辨荧光纳米微球抗体标记物喷涂于结合垫后，一般需要在37℃-45℃的环境中干燥12-24h，不合适的保护液配方可能导致在干燥过程中抗体失活，效价下降明显，同时也会影响产品的长期稳定性；⑤不适合的保护液会抑制抗原抗体反应，使效价降低。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于时间分辨荧光微球抗体标记物的喷膜保护液，用于解决现有技术中喷膜保护液的准确度、精确度、稳定性和抗破坏性差的问题，同时，本发明还将提供一种时间分辨荧光免疫层析试纸条。

2、为实现上述目的及其他相关目的，

3、本发明的第一方面，提供一种用于时间分辨荧光微球抗体标记物的喷膜保护液，所述保护液包括以下浓度（体积或质量体积比）的组分：0.05%-1%的小分子封闭剂、1%-15%的稳定剂、0.1%-5%的表面活性剂、0.1%-0.5%的信号增强剂，余量为ph在7.0-8.5的缓冲液。

4、采用上述技术方案，所述保护液有助于时间分辨荧光微球抗体标记物（简称：乳胶）在保存体系中处于均一分散的状态，呈现胶体状，不易聚集，有助于精密度的改善；同时还能使喷涂在结合垫上的乳胶很好地释放，降低结合垫上的乳胶残留，在层析过程中，展层均匀，荧光基线平整，对精密度与准确度都大有帮助；该保护液还能够抗样本基质干扰，样本适用范围更加广泛；最后保护液有助于乳胶的喷膜稳定性，在高温的老化下，乳胶上标记的抗体依旧保持高活性、高性能。

5、进一步的，所述缓冲液用于保持保护液在一定的ph范围，保证乳胶的表面价电荷，保护抗体活性，还能缓冲一些特殊样本的ph。具体的，所述缓冲液包括hepes、硼酸-硼酸钠、tris-hcl中的一种或几种的组合。其中，所述缓冲液的浓度为40mm-60mm，优选为50mm。

6、进一步，所述小分子封闭剂用于封闭微球表面未结合的羧基位点以及偶联的抗体上的部分羧基位点，减少乳胶聚集带来的颗粒不均，以及抗原抗体反应过程中出现的跳值等，也可替代牛血清白蛋白等惰性蛋白起到边层析边封闭，摆脱了对蛋白类物质的依赖，降低了成本。具体的，所述小分子封闭剂包括甘氨酸、赖氨酸中的一种或两种的组合。

7、进一步的，所述稳定剂用于消除单体间相互作用，降低非共价二聚体形成，并起到稳定蛋白单体形态及蛋白构象的作用，还能起到促进乳胶复溶与降低乳胶残留，延长干燥后乳胶的喷膜稳定性。具体的，所述稳定剂包括异丙醇、甘露醇中的一种或两种的组合。

8、进一步，所述表面活性剂用于提高亲水性，有助于乳胶释放的均一，防止抗原抗体等蛋白质在nc膜表面吸附。具体的，所述表面活性剂包括吐温20、ohodasurf on-870、igepal ca210的一种或几种的组合。

9、进一步的，所述信号增强剂用于抑制蛋白质的非特异性吸附，增强蛋白质的稳定性，进而大大提高效价。具体的，所述信号增强剂包括po-5。

10、于本发明优选的实施方式中，所述保护液包括以下浓度（体积或质量体积比）的组分：0.08%的小分子封闭剂、13%的稳定剂、1%的表面活性剂、0.3%的信号增强剂，余量为ph在7.5的缓冲液。

11、本发明的第二方面，提供一种时间分辨荧光免疫层析试纸条，包括：底板，和沿层析方向依次固定于所述底板上的样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫，且所述样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫顺次接触；所述结合垫上喷涂有上述保护液，所述保护液中包含时间分辨荧光微球抗体标记物，所述时间分辨荧光微球抗体标记物为偶联了抗体的时间分辨荧光微球。

12、进一步的，所述时间分辨荧光微球抗体标记物包括偶联了呕吐毒素抗体、黄曲霉毒素b1抗体或玉米赤霉烯酮抗体等的时间分辨荧光微球。

13、进一步的，所述保护液的制备方法具体包括以下步骤：

14、s1、按比例称取稳定剂和信号增强剂，加入缓冲液中；

15、s2、再取表面活性剂加入混合溶液，搅拌溶解；

16、s3、再加入小分子封闭剂混合均匀；

17、s4、最后将时间分辨荧光微球抗体标记物加入，混合均匀，得到配置好的保护液，保存备用。

18、在步骤s2中，搅拌溶解的时间至少1小时。

19、在步骤s4中，加入的时间分辨荧光微球抗体标记物的浓度（体积或质量体积比）为0.01％～2％。

20、在步骤s4中，保护液的保存温度为2℃-8℃，保存期限为7-15天。

21、进一步的，所述喷涂的具体步骤包括：将配制好的保护液喷涂于未处理的结合垫上，37℃-45℃的环境中干燥12-24h，得到所述结合垫。其中，所述处理液的喷涂量为1.5~2.0μl/cm。所述结合垫的保存温度为15℃-30℃，保存期限为1-2年。

22、现有的时间分辨荧光免疫层析试纸条，需要筛选结合垫、样品垫的原料，来改善免疫层析过程中的展层均一性差的问题，甚至需要加入一些阻断剂、惰性蛋白等来改善样本基质效应，且标记后的乳胶，需要当天标完立马喷涂，不然乳胶易聚沉，无法做到长时间保存。

23、但是，本发明无需要依赖垫纸材料、阻断剂、惰性蛋白等，通过配方成分及配比的调整，使标记后的乳胶在保护液中可以维持7-15天，在喷涂于结合垫后可以37℃-45℃维持2-3个月、或是15℃-30℃维持1-2年，不影响抗体的活性。同时，本发明的保护液中的成分简单、廉价、安全，降低了产品的成本。

24、如上所述，本发明的用于时间分辨荧光微球抗体标记物的喷膜保护液及其应用，具有以下有益效果：

25、1、本发明的喷膜保护液成分简单、廉价、环保，用量小，配制简单、批间差小，且摆脱了对结合垫与样品垫种类以及阻断剂和惰性蛋白的依赖。

26、2、本发明的喷膜保护液能够有效地维持乳胶在保护液中的胶体状态，降低乳胶颗粒间的碰撞，保护荧光微球的表面价电荷，大大减少了乳胶聚集的概率，从而有助于精密度的改善；同时，该保护液能够保护乳胶表面的抗体活性，保护抗体的二级空间结构，使得乳胶能较长时间地保存在喷膜保护液中（2-8℃保存7-15天）；乳胶喷膜后，在37℃-45℃的环境中干燥12-24h后能够长时间地保存（37℃-45℃维持2-3个月、15℃-30℃维持1-2年），不影响抗体活性；且喷膜在加样跑条中，乳胶能够从结合垫上完全地释放，展层均一，基线平整；在特殊样本基质中，该喷膜保护液的成分能够很好地缓冲各种极端ph，大大提高了产品的准确度。

27、3、本发明的喷膜保护液为类似的时间分辨荧光免疫层析的乳胶及其喷膜在实际检测与产品化推广应用等方面提供了保障。