一种苗药血人参HPLC指纹图谱的建立方法

本发明涉及药材多种成分测定方法，特别是一种苗药血人参hplc指纹图谱的建立方法。

背景技术：

1、血人参(indigofera stachyodes，iss)为豆科植物木蓝属茸毛木蓝(indigoferaatachyoides lindl)的干燥根，是苗族民间常用药，于2003年被《贵州省中药材、民族药材质量标准》收载，应用历史悠久，其味甘、微苦，性温，归肝、肾、大肠经，具有滋阴补虚、调经摄血、活血舒筋的功效，主治崩漏，主要分布于云南、贵州、福建、广西等地，尤以贵州贵阳、安顺、黔西南、黔东南等地分布广泛。

2、目前中药指纹图谱是评价中药最有效的方法之一，目前，血人参uplc指纹图谱或一测多评研究较少，因此，选择超高效液相色谱技术进行研究，一方面是为填补空白，其次是为缩短进样时间提高检测效率。本研究丰富了血人参药材的共有成分，并且通过指纹图谱相似度软件分析，表明不同地区血人参所含成分存在一定差异性，可能与产地、生长年限等因素有关。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，提供一种一种苗药血人参hplc指纹图谱的建立方法，能检测血人参中原花青素b1、原花青素b、儿茶素、原花青素b4、原花青素b2、表儿茶素、肉桂鞣酯b1、原花青素a2这8种化学成分的含量，该分析方法灵敏度高、专属性好，稳定可行。

2、本发明的技术方案：一种苗药血人参hplc指纹图谱的建立方法，所述方法按照以下步骤进行：

3、(1)混合对照品溶液①的制备：精密称取原花青素b1、原花青素b3和儿茶素对照品，置于容量瓶，加甲醇溶液定容至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液①；

4、(2)混合对照品溶液②的制备：精密称取原花青素b4、原花青素b2、表儿茶素、肉桂鞣酯b1和原花青素a2，置于容量瓶中，再精密吸取混合对照品溶液①1ml置于混合对照品溶液②中，加甲醇定容至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液②；

5、(3)供试品溶液的制备：取血人参样品，粉碎，过二号筛，称取粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液，称定重量，超声提取，放冷，甲醇溶液补足失重，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；

6、(4)色谱条件：采用infinitylab poroshell 120aq-c18色谱柱(2.1×150mm，2.7μm)流动相以0.1％磷酸水溶液为a相，乙腈为b相，进行梯度洗脱，流速0.2ml/min，检测波长202nm；柱温30℃，进样量3μl；

7、(5)将供试品溶液和混合对照品溶液②分别在色谱条件下进行uplc测定，将色谱图以aia格式数据导入国家药典委员会软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012版，以肉桂鞣酯b1峰的峰面积和保留时间为参照，分别计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间的rsd值。

8、前述步骤(1)中，混合对照品溶液①的制备：精密称取原花青素b1、原花青素b3和儿茶素对照品6.5-7.5mg、11.5-12.5mg、18.5-19.5mg，置于5ml容量瓶，加45-55％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为1.3-1.5mg/ml原花青素b1、2.3-2.5mg/ml原花青素b、3.7-3.9mg/ml儿茶素的混合对照品溶液①。

9、具体的说，前述步骤(1)中，混合对照品溶液①的制备：精密称取原花青素b1、原花青素b3和儿茶素对照品7.07mg、12.03mg、19.01mg，置于5ml容量瓶，加50％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为1.414mg/ml原花青素b1、2.404mg/ml原花青素b、3.802mg/ml儿茶素的混合对照品溶液①。

10、前述步骤(2)中，混合对照品溶液②的制备：精密称取原花青素b4、原花青素b2、表儿茶素、肉桂鞣酯b1和原花青素a2对照品9.5-10.5mg、5.5-6.5mg、4.5-5.5mg、15.00-17.00mg、8.5-9.5mg，置于100ml容量瓶中，再精密吸取混合对照品溶液①1ml置于混合对照品溶液②中，加45-55％甲醇定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为0.013-0.015mg/ml原花青素b1、0.0230-0.025mg/ml原花青素b、0.0370-0.0390mg/ml儿茶素、0.095-0.105mg/ml原花青素b4、0.055-0.065mg/ml原花青素b2、0.045-0.055mg/ml表儿茶素、0.1500-0.1700mg/ml肉桂鞣酯b1、0.085-0.095mg/ml原花青素a2的混合对照品溶液②。

11、具体的说，前述步骤(2)中，混合对照品溶液②的制备：精密称取原花青素b4、原花青素b2、表儿茶素、肉桂鞣酯b1和原花青素a2对照品10.01mg、6.03mg、5.02mg、16.00mg、9.05mg，置于100ml容量瓶中，再精密吸取混合对照品溶液①1ml置于混合对照品溶液②中，加50％甲醇定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为0.0141mg/ml原花青素b1、0.0240mg/ml原花青素b、0.0380mg/ml儿茶素、0.1001mg/ml原花青素b4、0.0603mg/ml原花青素b2、0.0502mg/ml表儿茶素、0.1600mg/ml肉桂鞣酯b1、0.0905mg/ml原花青素a2的混合对照品溶液②。

12、前述步骤(3)中，供试品溶液的制备：取血人参样品，粉碎，过二号筛，称取粉末0.49-0.51g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，加入55-65％甲醇溶液10ml，称定重量，超声提取35-45min，超声功率400w，超声频率40khz，放冷，55-65％甲醇溶液补足失重，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

13、具体的说，前述步骤(3)中，供试品溶液的制备：取血人参样品，粉碎，过二号筛，称取粉末0.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，加入60％甲醇溶液10ml，称定重量，超声提取40min，超声功率400w，超声频率40khz，放冷，60％甲醇溶液补足失重，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

14、前述步骤(4)中，洗脱程序为：0～10min，9.5％～12％b；10～40min，12％～25％b；40～41min，25％～100％b；41～42min，100％～100％b；流速0.2ml/min。

15、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

16、本发明对41批血人参样品进行uplc指纹图谱分析和相似度分析，发现共有36个共有峰，并用对照品指认其中8个共有峰，分别为2号峰(原花青素b1)、4号峰(原花青素b3)、6号峰(儿茶素)、8号峰(原花青素b4)、9号峰(原花青素b2)、11号峰(表儿茶素)、14号峰(肉桂鞣酯b1)、29号峰(原花青素a2)。其中39批血人参样品与对照指纹图谱的相似度均大于0.900，说明不同产地血人参药材质量相对稳定；s35和s37批血人参样品的相似度为0.881、0.890，表明这2批药材与其他批次药材具有一定差异。