一种用于乳酸检测的生物传感器及其制备方法

本发明属于传感器，具体涉及一种用于乳酸检测的生物传感器及其制备方法。

背景技术：

1、近几十年来，由于小型化柔性电子产品的快速发展和人类健康管理意识的增强，可穿戴电子产品在科学研究和商业化方面都取得了巨大的发展。柔性器件的独特性能，包括良好的拉伸性、低成本、高变形性、重量轻、良好的光学透明度和出色的便携性，使其成为可行的可穿戴电子产品的理想平台。根据定义，如果我们称一种技术为柔性可穿戴性，那么该设备能够方便地弯曲，性能几乎不会下降，并且很可能与人体表皮进行无创表面接触，无论是我们眼睛中的角膜还是皮肤上的角质层。近年来，随着物联网的极大关注，利用网络连接的可穿戴传感器，根据个体生理信号提供量身定制的诊断和治疗，为个性化医疗实践提供了有用的见解。鉴于医疗成本的增加、人类对健康和医学的认识和关注以及世界人口老龄化等问题，无疑为开发用于生物医学和定制医疗保健的可穿戴人体传感器提供了广阔的机会。

2、可穿戴生物传感器与个人便携式健康设备的结合近年来引起了广泛关注，因为它们可以实现不受空间和地点、也不受时间限制的即时检测。可穿戴生物传感器能够让个人从汗液、眼泪、间质液等人体体液中了解自身生理动态，用于医疗保健。最近，开发用于汗液乳酸定量的低成本、灵敏且可重复的生物传感器变得越来越重要，因为作为生物标志物，它可以指示许多疾病，包括乳酸性酸中毒、缺氧、呼吸衰竭、心力衰竭、脓毒症以及药物或毒素消耗，并促进运动医学中运动员身体状况的评估。汗液中的乳酸水平浓度范围为5至20mm，然而，它因生理活动、运动强度或疾病状态等而变化很大。因此，对汗液进行连续或实时监测汗液中的乳酸水平是一种方便且无创的健康保护方法。

3、电化学装置由于操作简单、信号连续、特异性高、背景噪声低和响应时间快而被开发用于乳酸传感。同时，可穿戴式电化学生物传感器在汗液分析中仍存在需要解决的挑战，包括弯曲过程中的信号波动、灵敏度、传感电极的腐蚀、实时监测能力和长期稳定性等。目前大多数乳酸生物传感器都基于乳酸氧化酶(lox)，其中乳酸是通过过氧化氢(h2o2)的直接电化学分析或通过附加酶间接测定的——过氧化物酶。可见，这种双酶系统可能会使传感电极的制备过程复杂化并增加生物传感器的成本。此外，天然酶通常受到严格的操作条件(温度、ph)、稳定性、高底物特异性的限制。

技术实现思路

1、本发明的目的是解决上述问题，提供一种基于可穿戴生物传感器传感器在构建和对汗液的分析检测等方面仍然存在无法提供汗液样本的持续收集，对皮肤的伤害灵敏度低和稳定性差以及多种模块难以集成等现实问题，能进行非侵入式的检测，并且能够实时、连续、准确及长时间检测和和分析人体汗液乳酸水平件的用于乳酸检测的生物传感器及其制备方法。

2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种用于乳酸检测的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

3、s1、准备材料；

4、s2、制备溶液；

5、s3、制备电化学反应层，得到乳酸传感器。

6、进一步地，所述s1中的材料包括：二硫化钼(mos2)粉末、氧化铈(ceo2)纳米颗粒、壳聚糖和氯金酸(haucl4·4h2o)、乳酸氧化酶(lox)(42u/mg)、乙酸。

7、进一步地，所述s2中制备溶液包括制备复合纳米酶溶液和乳酸氧化酶溶液，其中制备复合纳米酶溶液包括以下步骤：

8、s211、通过超声辅助液体剥离工艺制备了mos2纳米片；

9、s212、将30mg大块mos2加入10ml45体积％乙醇的水溶液中；

10、s213、然后将悬浮液浴超声处理(2330w)12小时，然后以3000rpm离心30分钟，收集mos2纳米片上清液以供进一步使用；

11、s214、通过将100mgceo2纳米颗粒混合到10mlmos2纳米片上清液中，然后超声处理2小时，获得ceo2-mos2纳米复合材料的合成。

12、s215、将分散体静置1小时，直到完全形成白色沉淀，收集上清液以供进一步使用。

13、进一步地，所述乳酸氧化酶溶液的制备包括以下步骤：

14、s221、首先称量壳聚糖，加入乙酸，形成0.5％壳聚糖溶液；

15、s222、然后加入lox，制备乳酸氧化酶的浓度为25u/100μl。

16、进一步地，所述s3中制备电化学反应层包括以下分步骤：

17、s31、首先将10μl的ceo2-mos2纳米复合材料溶液滴在工作电极we上，并在室温下风干；

18、s32、通过使用10mm的haucl4·4h2o将电势从-0.9v扫描到+0.2v达480s v，将金纳米粒子(aunps)电沉积到ceo2-mos2涂层的we上；

19、s33、最后，用超纯水冲洗掉we上多余的杂质；

20、s34、将分散在0.5％壳聚糖中10μl的lox(25u/100μl)逐滴添加到ceo2-mos2/au涂层的we上，然后在室温下空气干燥3小时；

21、s35、然后制备成乳酸传感器，并将其储存在4℃的冰箱中以备进一步使用。

22、进一步地，采用权利要求1所述的一种用于乳酸检测的生物传感器的制备方法制得乳酸传感器。

23、本发明的有益效果是：

24、1、本发明所提供的一种用于乳酸检测的生物传感器及其制备方法，所制备的复合纳米酶电化学反应层，首先对纳米二氧化铈、纳米二硫化钼和复合纳米材料使用sem表征表面形貌和层状结构。其中二氧化铈为球状，尺寸大约为25纳米。二硫化钼形状为片状，并且为单层结构，大小是150纳米左右。球状的二氧化铈分布在片状的二硫化钼的表面和边缘处，复合界面形成ce–o–mo键，形成异质结构。通过ca和cv测量来进一步表明复合材料优越的性能。复合的ceo2-mos2相对于单独的二氧化铈对h2o2的催化能力提高，通过电沉积的方法增强传感层的电子转移，能够用肉眼就能观察到纳米金颗粒的形成。加上纳米au增强乳酸氧化酶月传感层的电子转移能力。

25、2、本发明所制备传感器的乳酸检测性能，将lox酶固定在ceo2-mos2/au修饰的we上，形成具有高选择性的一次性乳酸传感器。分别在pbs和商业人工汗液中研究所制备的可穿戴乳酸生物传感器在添加不同浓度(0.1至50mm)的乳酸时的响应。所制备的可穿戴乳酸生物传感器的计时电流响应与乳酸浓度成比例，第一线性范围为0.1～1mm，第二线性范围为1～50mm。在掺有乳酸的pbs中，在第一/第二线性范围内，灵敏度分别计算为25.58μamm-1cm-2(r2＝0.981)和2.35μamm-1cm-2(r2＝0.988)。类似地，在添加乳酸的人造汗液中，灵敏度计算为25.53μamm-1cm-2(r2＝0.993)和2.29μamm-1cm-2(r2＝0.976)。检测限(lod)低至0.052mm(pbs)和0.135mm(人工汗液)通过3σ/s实现，其中s是乳酸生物传感器的灵敏度，σ是空白测量的相对标准偏差。这种活性范围与人体汗液中生理表达的乳酸水平相匹配。所有试验的相对标准偏差(rsd)均小于5％(n＝3)，表明可接受的重复性。

26、3、本发明所制备传感器的选择性，为了评估用ceo2/mos2/au/lox构建的可穿戴乳酸生物传感器的选择性，对汗液中存在的特定物质(100mm nacl，5mm葡萄糖，1mm酪氨酸，0.1mm尿酸)进行了阴性对照实验。显示了从空白的10mm标准乳酸溶液，含有10mm乳酸和不含乳酸的干扰物质混合物中获得的计时电流响应。只有含有乳酸(10mm)的样品才会产生明显的电流变化。此外，含有10mm乳酸的混合物的电流响应与10mm的标准乳酸样品相当，表明所提出的可穿戴乳酸生物传感器具有良好的选择性。

27、4、本发明所制备传感器的重复性和再现性，从rsd评估传感器到传感器的再现性，以测量10mm乳酸，使用五种不同的所得乳酸生物传感器，产生约2.2％。通过连续测试生物传感器在已知浓度的pbs(ph7.4，0.1m)中的乳酸溶液来研究所制备的生物传感器的可重复性，以检查其再利用。连续五次测量的rsd为2.4％，表明生物传感器具有良好的重复性。

28、5、本发明所制备传感器的弯曲性和稳定性，考虑到可穿戴生物传感器在附着在皮肤上时可能会弯曲，这可能会限制其性能，因此测试了弯曲角度变化对输出电流信号的影响。当测试5mm的乳酸样品时，所制备的生物传感器在0°、30°、60°和90°的角度下工作良好。观察到弯曲角度可能对检测产生一定影响，当角度增加超过30°时，检测到输出电流有4.2％的变化，但是这种变化在统计学上并不显着(p>0.05)。此外，将制备良好的生物传感器保存在4℃下，并通过在25天内每6天测量5mm的乳酸样品来研究生物传感器的长期稳定性。输出电流在25天内保持初始值的96.6％，表明生物传感器具有良好的稳定性。

29、6、本发明所指标传感器与elisa的对比，本发明所提出的纳米酶电化学乳酸纳米生物传感器的准确性通过所提出的生物传感器和elisa测定法在检测加标乳酸样品(1.0mm，5.0mm，10.0mm和20.0mm)中的并排比较来验证。所提出的生物传感器的测试结果与elisa的测试结果相关，回收率和rsd分别为94.3％至103.7％和2.7％至4.7％，表明所制备的生物传感器具有良好的准确性和精密度。另外，检测时间从2小时缩短到5分钟左右。