一种单细胞在线延长裂解质谱流式分析装置

本技术涉及以单细胞为分析对象的一种延长裂解质谱流式分析技术，具体涉及一种能够实现包括细胞单分散、单细胞超声裂解、非接触式电喷雾离子化以及单细胞水平代谢物以及异构体质谱检测的装置。

背景技术：

1、细胞是生物体的最小功能单元，传统生物学技术通常将大量细胞群体作为研究对象，尽管这样的研究方式奠定了现有生物学理论的基本框架，但是平均的实验结果忽略了细胞异质性这一重要的细胞特点，对于准确理解每一个细胞的生理过程带来了巨大的障碍，同时也掩盖了稀有细胞群体的相关信息。因此，对于每个细胞进行独立的分析与测量，不仅可以有助于揭示细胞在特定环境下的真正生理过程，例如衰老、分化以及信号传导等等，还可以对于稀有细胞群体同时进行无歧视的分析，这对于全面了解细胞群体的分类以及在特定疾病背景条件下相关细胞亚型的发现以及疾病靶标的挖掘都具有十分重要的意义。但是由于单个细胞尺寸小，内容物极为有限，正常体细胞中仅为fl-pl级，代谢物含量低，种类丰富，异构体多样且动态范围宽，因此也对现有的生命分析技术在灵敏度、分析通量、动态范围以及结构鉴定能力方面提出了巨大的挑战。

2、质谱作为一种高灵敏、高通量、检测范围宽且具备良好定性能力的分析工具，在单细胞代谢物分析领域发挥着十分重要的作用。在此基础上，现有单细胞代谢物分析方法根据分析通量以及代谢物覆盖度主要分成了两类，一类主要是采取显微操作来吸取或萃取内容物，之后进行质谱分析的方式，此类方法虽然细胞分析通量低，操作难度大，但是代谢物覆盖度高，定性以及绝对定量能力强，代表性的方法见文献(b.shrestha,a.vertes.anal.chem.,2009,81,8265-8271和n.pan,w.rao,n.r.kothapalli,r.liu,a.w.g.burgett and z.yang.anal.chem.,2014,86,9376-9380)，结合诱导喷雾的电离模式，喷雾时间可以进一步延长，代表性的方法见文献(h.zhu,g.zou,n.wang,m.zhuang,w.xiong and g.huang.proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2017,114,2586-2591)；而另一类方法则是将细胞实现单分散后依次进入质谱检测，细胞完整性在分离过程中得到保持，此类方法虽然分析通量高，操作相对而言更为简便，但是由于破裂过程仅仅发生在电喷雾过程的瞬间，因而单细胞检测窗口十分狭窄，代谢物覆盖度包括结构鉴定以及定量能力均有所欠缺，代表性的方法见文献(yao,h.,h.zhao,x.zhao,x.pan,j.feng,f.xu,s.zhang andx.zhang.anal.chem.,2019,91,9777-9783.和xu,s.,m.liu,y.bai andh.liu.angew.chem.int.ed.2021,60,1806-1812.)。因此，在保证较高细胞分析通量的同时，如何尽可能延长单细胞检测时间，使更多胞内内源性代谢物得以检出，进而提高结构鉴定能力，是单细胞代谢组学分析方法未来亟待解决的问题。

技术实现思路

1、为了实现在高通量细胞分析的同时，延长单细胞检测窗口，从而提高一级质荷比数据的采集分辨率，以及二级代谢物结构定性能力，包括对结构异构体的区分，弥补现有方法中单细胞检测时间短、细胞分析通量低、代谢物覆盖度不足以及不具备二级结构鉴定能力等问题，本实用新型旨在提供一种普适性的，超声辅助在线单细胞延长裂解的质谱分析装置，从而延长单细胞检测窗口，提高代谢物覆盖度，在提高一级质荷比数据的准确性同时获得单细胞水平下的二级结构信息，并且结合特征性片段来对异构体的单细胞表达情况进行定性定量分析。

2、本实用新型提供的一种单细胞在线延长裂解质谱流式分析装置，包括细胞单分散装置、超声装置、非接触式电喷雾喷针和质谱检测器，其中所述细胞单分散装置为分离毛细管，毛细管的前段呈螺旋缠绕状，后段的一部分位于超声装置中，尾部与非接触式电喷雾喷针相连，非接触式电喷雾喷针对准质谱检测器的入口。

3、分离毛细管一端入口注射细胞悬浮液，经分离毛细管实现单细胞分散，之后通过超声空化作用使得流经细胞发生在线裂解过程，而毛细管另一端出口与非接触式电喷雾喷针相连，最终借助非接触式电喷雾的方式在喷针部分将局域细胞内容物离子化，从而进入质谱检测。

4、上述用于单细胞分析的在线延长裂解质谱流式分析装置中，细胞单分散装置可以选择内径150-250μm的石英毛细管，外涂层为聚酰亚胺，螺旋缠绕段的螺旋圈数为5-8圈，螺旋直径为6-10cm。细胞悬浮液在注入细胞单分散装置后，于螺旋缠绕段在迪恩流微流体作用下，产生的剪切应力梯度会对细胞悬液中的细胞进行排序和分离，从而得到单分散的细胞排列形式。螺旋圈数与直径会直接影响迪恩流的剪切力大小从而影响细胞分散效果。

5、所述超声装置可以采用功率50-200w，超声频率40khz的超声波清洗器。单分散细胞在经过浸入超声冰浴中的毛细管后，由于受到超声空化作用，加速细胞膜破裂以及内容物释放，最终形成局域化的内容物溶液。位于超声装置中受到超声处理的毛细管长度一般为10-15cm。

6、本实用新型的单细胞在线延长裂解质谱流式分析装置中，优选的，所述分离毛细管为带有聚酰亚胺涂层的石英毛细管；所述非接触式电喷雾喷针一般由不带涂层的石英毛细管制成，通过等径二通与分离毛细管相连。喷针尖端内径为30-60μm，喷针外壁通过缠绕铜丝施加直流诱导电场。在诱导电场作用下，电喷雾过程得以形成，待分析物以离子形式进入质谱检测器。

7、所述质谱检测器适用于离子阱质谱、四极杆质谱、三重串联四极杆质谱、飞行时间质谱、静电场轨道阱质谱和/或傅里叶变换离子回旋共振质谱等的测定。

8、基于上述装置进行超声辅助单细胞在线延长裂解的质谱流式分析方法，其实现包括细胞悬浮液的制备，细胞的进样及单分散，超声处理，非接触式电喷雾离子化及质谱检测、数据处理等步骤。具体如下：

9、1)配制一定浓度的细胞悬浮液样品c1，c2，…，cx，其中x为自然数，代表细胞样品序号；

10、2)将细胞悬浮液样品通过注射器注入上述在线延长裂解质谱流式分析装置中的细胞单分散装置，对细胞进行在线超声裂解和质谱检测；

11、3)数据分析，包括：在步骤2)获得的质谱检测结果中提取多张单个细胞连续分析时间大于10s的台阶状总离子流图，取总离子流强度最高的质谱图作为该细胞的分析质谱图，依据总离子流强度进行归一化，从而获得每个细胞中代谢物的相对表达强度；根据单细胞二级质谱数据，通过对异构体的特征二级质谱峰强度进行比较，获得单细胞内不同异构体的表达分布情况。以上数据可作为后续细胞分型、以及代谢物差异性分析的依据。

12、上述步骤1)实现细胞悬浮液的制备。将离心收集得到的对数生长期的细胞洗涤除盐后重悬于分散液中，获得待测细胞悬浮液样品。

13、优选的，上述待测细胞悬浮液样品的浓度为1000-10000个/ml，待测细胞样品可以是单一细胞系的细胞、混合多种细胞系的细胞、未知的细胞悬浮液样品等。

14、步骤1)中，可以采用80％甲醇水溶液对细胞进行洗涤，最终用于分散细胞的分散液是具有细胞固定作用的有机溶液(如甲醇水溶液等)，优选为冰冷的80％甲醇水溶液。

15、步骤2)用于细胞的在线超声裂解以及质谱检测。利用上述在线延长裂解质谱流式分析装置对细胞样品的具体分析过程如下：将所制得的细胞悬浮液通过注射泵的推动作用输送至螺旋缠绕状毛细管部分,细胞单分散后进入超声装置，在冰水浴中超声空化作用促使细胞裂解，从而获得局域化的单细胞裂解内容物，内容物溶液逐步进入非接触式电喷雾喷针中，在诱导电场的作用下实现离子化，最终通过质谱检测器进行检测，记录随时间变化的质谱离子流图以及每一时刻采集的质谱图。其中，可以通过商品化纳升电喷雾离子源向喷针外缠绕铜丝施加直流高压来实现诱导电场。

16、优选的，步骤2)的每次进样体积为0.2-0.5ml，注射器进样的流速设置为0.5-3μl/min。

17、步骤2)中优选的超声条件为冰水浴，毛细管浸入冰水浴中的长度为10-15cm。

18、向非接触式电喷雾喷针施加的诱导电压一般为直流高压，可以为正模式或负模式，电压值可设置为2-4kv。施加的电压也可以为脉冲型高压，可以为正模式或负模式，峰值可以为2-4kv，频率可以为10-10000hz。

19、采集的质谱优选为高分辨质谱，全扫分辨率大于30000，采集模式为全扫描或者全扫/二级交替扫描模式，其中二级扫描对象为全扫中前七强的离子，采集范围为m/z 100-1500，每次采集数据时间为大于60min，每分钟能够采集2-3个细胞的质谱信息。

20、由于细胞内源性代谢物种类丰富，且挥发能力以及极性范围均跨度较大，所以结合两种甚至多种离子化方式将会有利于扩大代谢物分析范围，从而进一步提高单细胞代谢物鉴定覆盖度。电喷雾(electrospray ionization，esi)方法主要有利于极性大且挥发能力较好的小分子检测，而对于低极性的小分子代谢物以及脂质检测仍然有所局限，且离子抑制现象严重。基于等离子体的彭宁离子化作用可以对中等极性或者弱极性的化合物进行分析，与esi离子化模式适用的分析物互为补充。通过再放电室中对通入的工作气体(如氦气、氮气或氩气等)经电晕放电产生等离子体，其中的激发态原子瞬间解吸并离子化样品中的化合物，实现质谱检测。该技术无需引入溶剂，无抑制效应，对非极性物质有很好的检出能力，且装置简单。两种离子化方式结合，可提高单细胞代谢物鉴定范围，同时作为一种后离子化方式进一步提高离子化效率，从而提高方法灵敏度。具体做法是，搭建等离子体发生装置，对电喷雾离子化样本进行后离子化，然后进行质谱检测(参见图7)。所述等离子体发生装置形成的等离子体出射方向与非接触式电喷雾喷针尖端与质谱检测器入口的连线呈一定角度(15～90度)。同时，在质谱检测器入口处设置机械抽气泵保证入口处的真空度。所述等离子体发生装置可以采用包括但不限于实时直接分析(dart)离子源、低温等离子体(ltp)离子源、介质阻挡放电(dbdi)离子源、流动大气压余辉(fapa)离子源等离子源。

21、在本实用新型的一个实施例中，对浓度为10000个/ml mcf-7细胞悬浮液样品进行分析，进样流速为1μl/min，细胞单分散装置为外径360μm、内径150μm的石英毛细管，外涂层为聚酰亚胺，螺旋缠绕段的螺旋圈数为6圈，螺旋直径为8cm。分离毛细管浸入超声冰浴的长度为15cm，出口通过等径二通与去掉涂层的毛细管电喷雾喷针相连，喷针尖端内径为50μm，外径为150μm，通过管壁缠绕铜丝施加-3kv的直流诱导电场。采用orbitrap质谱仪进行检测，全扫分辨率设置为35000，二级扫描分辨率设置为17500，采集范围为m/z 100-1500，采集时间为60min。在获得的质谱图中，平均脉冲时间大于20s，此外还有大量质核比m/z在100-1500范围内的细胞内代谢物，通过二级谱图采集也获得了多对异构体的结构以及强度信息。

22、上述步骤3)为数据分析，在获得的总离子流色谱图中，在每个单细胞脉冲中总离子流图信号强度最高点获得该单细胞的质谱图，对单细胞质谱图进行如下数据处理：

23、3-1)按照代谢物的理论质核比提取谱图中相应代谢物的信号强度m1，m2，…，mb，b为鉴定到的代谢物数目，质核比的容忍误差为5ppm以内；

24、3-2)以总离子流强度s为基准对代谢物信号强度进行归一化，归一化后的强度分别为m1/s，m2/s，…，mb/s，因此可以获得每个细胞的质谱检测结果：cx((m1/s)x，(m2/s)x，…，(mb/s)x)，x代表细胞样品序号。

25、3-3)在单细胞二级质谱图中，一对异构体a的特征峰强度分别为ia1,ia2，因此可以获得每个细胞中不同异构体的质谱检测结果：cx((ia1/ia2)x，(ib1/ib2)x…(in1/in2)x)，x代表细胞样品序号，n为异构体分析数目。

26、步骤3-2)以及3-3)获得的多个细胞的质谱检测结果可以汇总为一个数据矩阵：

27、

28、利用单细胞中检测到的变量的归一化强度值(即上述数据矩阵中的各个变量，包括代谢物以及异构体)，利用数据分析算法(如主成分分析、可视化聚类、火山图、热图等)进行细胞的分型、鉴定，以及差异性分析和代谢通路研究等相关应用。

29、本实用新型提供的超声辅助单细胞在线延长裂解质谱流式分析装置是一种普适性好、通量高且具备较强结构鉴定以及区分能力的单细胞分析装置。单细胞分析时间的延长，不仅为更高分辨的一级质荷比信息采集提供充足时间，此外也使得在单细胞层面进行二级结构鉴定成为可能，因此确保了本实用新型的单细胞在线延长裂解质谱流式分析装置在异构体区分以及定性定量分析中的应用。本实用新型的超声辅助单细胞在线延长裂解质谱流式分析装置能够用于细胞鉴定、细胞分型、差异性代谢物以及异构体研究，在生物标志物挖掘、肿瘤诊断等领域都具有广阔的应用前景。

30、本实用新型中用于细胞分散的装置是一种结构简单、成本低廉的流式细胞处理装置，具备细胞进样、细胞分散与排列的功能，不同内径与外径的毛细管均可加工，并且与超声装置有着较好的兼容性，能实现每分钟2-3个细胞的在线裂解以及分析，且该部分装置具有通用性，对于细胞类型不受限制，且能适配于多种不同类型的质谱质量分析器。

31、本实用新型中用于细胞裂解的超声装置可以采用实验室中常用的超声波清洗器，装置简便且价格低廉，通过调整毛细管浸入液面长度即可对超声过程进行控制。

32、本实用新型中使用的离子化方式为非接触式电喷雾，通过管壁外缠绕铜丝的方式可以实现直流诱导电场的施加，相比于常规的交流脉冲产生设备更加简便，且易于操作。此外，此种电离方式省去了接电三通的液路接口，因此大大缓解了细胞碎片堵塞管路的情况发生，对于长时间、大批量细胞样本分析的实验平行性至关重要。等离子体后离子化方式进一步扩展了单细胞在非极性物质的检出范围，扩大单细胞代谢物鉴定数量和种类。