基于适配体纳米磁珠的水中Kana检测试剂及制备和检测方法

本发明涉及电化学生物传感器，具体涉及一种基于适配体纳米磁珠的水中kana检测试剂及制备和检测方法。

背景技术：

1、氨基糖苷类抗生素具有光谱的抗菌作用，卡那霉素（kana）是从链霉菌或小单胞菌培养液中提取，或以天然品为原料合成的抗生素。卡那霉素选择性地与细菌核糖体30s亚基上的靶蛋白结合，错误诱导而合成异常功能的蛋白质，达到杀灭细菌目的。临床上可用于耐药性金黄色葡萄球菌和某些革兰氏阳性菌所致的败血症，肺部感染及其他多种严重感染疾病。目前国内临床上主要使用kana抑制细菌的生长繁殖，如葡萄球菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等。因其价格低廉，抗菌性强，kana也是畜禽养殖普遍应用的兽药。然而滥用kana可造成动物性食品残留量超标，人类长期食入会给身体带来肾毒性、造血系统的毒性及其他毒副作用。根据gb 31650-2019国家标准明确规定动物源性食品肌肉、皮脂中卡那霉素的最高残留量为100 μg/kg，牛、羊奶中的卡那霉素最高残留量为150 μg/kg，肝脏中卡那霉素的最高残留量为600 μg/kg。根据最新国家标准gb31650.1-2022食品中41种兽药最大残留限量规定，家禽的蛋类中的卡那霉素允许的最高残留量为10 μg/kg，为了落实最新国家标准的要求，就要求工作人员对卡那霉素的检测具有即时性，寻求高效的检测方法与装置对kana残留量进行快速测定，已成为相关环保领域亟待解决的难题。

2、基于核酸适配体的即时检测技术近些年已成为检测抗生素的主流，这类传感器在检测kana上常表现出特异性强、灵敏度高、重现性好等优点，然而目前的kana检测设备均是较为笨重的实验室仪器，已不能满足工作人员对卡那霉素随时随地检测的灵活性要求。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述问题，本发明提供一种基于适配体纳米磁珠的水中kana检测试剂及制备和检测方法，实现对kana的现场定量便携式检测，以解决现有kana检测设备不能满足工作人员对卡那霉素随时随地检测的灵活性要求的技术问题。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、基于适配体纳米磁珠的水中kana检测试剂，包括蔗糖和适配体纳米磁珠，所述适配体纳米磁珠由连接有kana适配体的纳米磁珠与采用蔗糖转化酶标记的kana适配体的互补链经双链杂交反应而制得。

4、作为优选地，所述kana适配体的序列如seq id no:1所示；所述kana适配体的互补链的序列如seq id no:2所示。

5、seq id no:1 5’- cooh-tgggggttgaggctaagccga-3’

6、seq id no:2 5’- tcggcttagcctcaa -sh-(ch2)6-3’

7、基于适配体纳米磁珠的水中kana检测试剂的制备方法，适配体纳米磁珠的制备过程如下：

8、（1）制备氨基化纳米磁珠：将fecl3·6h2o溶解在乙二醇中，加入无水乙酸钠和1,6-己二胺，将溶液密封并在高压、180~210℃环境中反应6~12h，之后用水和乙醇反复洗涤，除去过量溶剂，最后真空干燥后得到氨基化磁珠备用；

9、（2）在纳米磁珠上连接kana适配体：采用羧基修饰kana适配体，并将羧基修饰kana适配体加入到磷酸盐缓冲液中并进行孵育以激活羧基，在适配体溶液中加入步骤（1）所得的氨基化磁珠并进行孵育，使活化的羧基修饰的适配体通过酰胺化反应固定在氨基化磁珠表面，并在磷酸盐缓冲液洗涤后进行磁选，得到apt-mbs备用；

10、（3）采用蔗糖转化酶标记kana适配体的互补链：将胺-巯基交联剂（sulfo-smcc）溶于dmso中，再将蔗糖转化酶溶于buffer a中，并将两种溶液混合后摇匀在室温下充分反应；反应结束后转移到超滤管中进行离心，其离心产物smcc-invertase截留在膜表面，离心完成后弃去超滤管下层液体，再加入buffer a搅拌均匀进行离心，对产物进行洗涤，将洗涤并超滤好的smcc-invertase转移至新的离心管，并加入kana适配体的互补链cdna，在室温条件下反应，反应完成后将溶液转移到超滤管内，再进行离心，使标记成功的cdna-invertase截留于膜上方，离心结束后，弃去下层液体，并加入buffer a混匀离心进行洗涤，得到蔗糖酶-cdna备用；

11、（4）将步骤（2）所得的apt-mbs和步骤（3）所得的蔗糖酶-cdna，室温混合，以完成双链的杂交反应。

12、进一步地，步骤（2）中，激活羧基的激活反应温度为80~100℃，激活反应时间为5min，激活后在室温环境下冷却。

13、进一步地，步骤（2）中，适配体连接氨基化磁珠的反应温度为37℃，反应时间为30min。

14、进一步地，步骤（2）中，氨基化磁珠加入前需要进行如下处理：将氨基化磁珠分散在含1%戊二醛、ph为 7.4的磷酸盐缓冲溶液中在室温进行搅拌，然后用清水充分冲洗掉过量的戊二醛。

15、进一步地，步骤（2）中，激活羧基的磷酸盐缓冲溶液中，磷酸盐的浓度为10 mm，1,2-二氯乙烷的浓度为10 mm，n-羟基丁二酰亚胺的浓度为 30 mm，ph为 6.8。

16、进一步地，步骤（2）中，洗涤apt-mbs的磷酸盐缓冲溶液中，磷酸盐的浓度为10 mm，ph为 6.8。

17、进一步地，步骤（3）中，所述kana适配体的互补链cdna在与smcc-invertase反应前还要进行纯化操作：加入制备好的互补链、磷酸钠缓冲溶液、tcep，混合以还原巯基标记的dna并减少二硫键形成，将混合物在25℃下孵育1小时，然后将溶液转移到超滤管中进行离心，最后用buffer a纯化得到纯化cdna备用。

18、采用kana检测试剂进行水中kana含量检测的方法，采用如下步骤进行检测：

19、（1）使用前先用0.22 µm的针头式过滤器过滤，以除去水样中的不溶物等杂质，随后将样品配置成ph 7.4的缓冲溶液；

20、（2）将适配体纳米磁珠充分分散于样品缓冲溶液中；

21、（3）将适配体纳米磁珠通过磁分离后从溶液中除去；

22、（4）向除去适配体纳米磁珠的溶液中加入过量蔗糖，并采用血糖仪测量溶液的葡萄糖含量，根据血糖仪的数值与标准溶液数值进行对比，将血糖仪的数值换算成kana含量。

23、综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：

24、1、本发明通过氨基化纳米磁珠与适配体偶联，葡萄糖作为信号转换器，设计了一种血糖仪快速检测水中卡那霉素（kana）的传感方法。实验中首先合成了带有氨基的纳米磁性微球，借助磁铁的磁分离作用使转化酶水解蔗糖，利用血糖仪进行检测，根据葡萄糖浓度与血糖仪示数之间的关系，间接实现了对kana的检测，可以满足工作人员对卡那霉素随时随地检测的灵活性要求。

25、2、本发明提供的检测方法，在优化完相关实验条件后，可以在1-200 nm的范围内实现kana的检测，检出限为0.28 nm。同时表现出优异的选择性，该传感器成功应用于环境水样中的kana检测，表明该方法具有极大的应用前景。