一种多糖结合疫苗的快速检测方法及试剂盒与流程

本申请涉及疫苗检测，特别涉及一种多糖结合疫苗的快速检测方法及试剂盒。

背景技术：

1、多糖结合疫苗是指采用化学方法将多糖共价结合在蛋白载体上所制备成的疫苗。现如今，由b型流感嗜血杆菌(hib)、肺炎链球菌(sp)(10至20种血清型)、脑膜炎奈瑟菌(nm)(a、c、w、y)和伤寒沙门氏菌vi(vi)与载体蛋白化学偶联的多糖抗原组成的糖结合疫苗已被批准。在多糖结合疫苗的研发过程中，由于细菌性多糖分子量大，反应位点多，检测困难等特异性，在筛选不同的多糖以及同一种多糖不同的反应条件时，需要经过多次实验来对多糖结合疫苗进行检测，进而获取最佳的实验条件，而无法像小分子药物研发时一样一次性平行做多个反应，造成了多糖结合疫苗在研发过程中周期长，投入物料多、检测耗时等问题。因此，有必要开发一种多糖结合疫苗的快速检测方法及试剂盒。

技术实现思路

1、本申请的主要目的是提供一种多糖结合疫苗的快速检测方法及试剂盒，旨在解决现有的多糖结合疫苗检测周期长的技术问题。

2、为实现上述目的，本申请提出了一种多糖结合疫苗的快速检测方法，包括以下步骤：

3、选取不同类型的多糖并分别解聚成不同分子量，得到待反应的多糖溶液；

4、将所述待反应的多糖溶液分别加入多孔板的孔中，并在所述多孔板的孔中分别加入不同倍数的反应试剂，分别调节所述多孔板的各个孔中溶液的ph值，再冻干保存，得到试剂盒；

5、在所述试剂盒中加入连接剂进行反应，使所述试剂盒中的多糖上具有裸露的氨基，再加入乙醇和氯化钠，于2℃-8℃下保存，再离心，去除上清，得到含多糖衍生物的试剂盒；

6、在所述含多糖衍生物的试剂盒中加入显色剂进行显色反应，通过紫外分光光度法测定所述含多糖衍生物的试剂盒中各个孔中溶液的吸光度值，计算得出反应收率，完成检测。

7、可选地，所述在所述试剂盒中加入连接剂进行反应，使所述试剂盒中的多糖上具有裸露的氨基的步骤，包括：

8、在所述试剂盒中加入连接剂，在4℃下反应过夜，使所述连接剂连接到所述试剂盒中的多糖上，所述连接剂上具有氨基基团。

9、可选地，所述连接剂为己二酸二酰肼，所述连接剂与所述试剂盒中的多糖的质量比为(4-5)：1。

10、可选地，所述加入乙醇和氯化钠，于2℃-8℃下保存，再离心，去除上清，得到含多糖衍生物的试剂盒的步骤，包括：

11、在所述试剂盒中加入无水乙醇和0.1％-0.2％的氯化钠，于2℃-8℃下保存3h-5h，得到沉淀，再离心25min-35min，去除上清，得到含多糖衍生物的试剂盒。

12、可选地，所述显色剂为三硝基苯磺酸。

13、可选地，所述在所述含多糖衍生物的试剂盒中加入显色剂进行显色反应的步骤，包括：

14、在所述含多糖衍生物的试剂盒中加水对所述多糖衍生物进行溶解后，加入显色剂和四硼酸钠，所述氨基与所述显色剂发生显色反应。

15、可选地，所述通过紫外分光光度法测定所述含多糖衍生物的试剂盒中各个孔中溶液的吸光度值，计算得出反应收率的步骤，包括：

16、采用紫外分光光度法测定所述含多糖衍生物的试剂盒中各个孔中溶液的吸光度值；

17、将所述吸光度值带入标准曲线，得到所述氨基的浓度；

18、根据所述氨基的浓度，计算得出所述多糖与所述连接剂的连接效率，得到反应收率。

19、可选地，所述多孔板为96孔板。

20、可选地，所述反应试剂包括n-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐。

21、本申请还提出了一种多糖结合疫苗的快速检测试剂盒，包括96孔板，所述96孔板的各个孔中装填有不同类型和不同分子量的多糖，且所述96孔板的各个孔中ph值不同，所述96孔板的各个孔中还装填有不同反应倍数的反应溶剂。

22、本申请依据多糖结合疫苗制备过程中的重要影响因素，通过一次性实验来快速获取多糖结合疫苗研发过程中的实验结果，由于不同多糖的类型会对结合疫苗的免疫原性有较大影响，且同一种多糖在不同的解聚条件下，解聚得到不同的分子量，而多糖的分子量过大与过小时都会影响多糖蛋白结合物的分子量，进而影响多糖蛋白结合物的免疫原性，同时，在多糖与蛋白的结合反应时，ph值也是关键反应条件，不同的反应适用的ph不同，有些反应如果ph过低，偏酸性，会产生副产物，而如果ph过高，偏碱性，会导致不反应，所以在制备多糖结合疫苗时，还需要对反应ph进行筛选，而结合反应时反应试剂的投入量也是影响反应收率的重要因素，因此，反应试剂的倍数也是多糖结合疫苗免疫原性的重要考察条件。故本申请在多孔板中同时加入了不同类型的多糖、同种多糖设置了不同的分子量，并设置了不同的反应ph和反应试剂倍数等多糖结合疫苗的关键反应条件，再通过连接剂使多糖具有裸露的氨基，而氨基可与显色剂发生特异性显色反应，裸露的氨基越多，显色越明显，通过测试含多糖衍生物的试剂盒中各个孔中溶液的吸光度值，即可得出不同的反应收率，依据反应收率，即可筛选出多糖结合疫苗的最佳反应条件。本申请可一次性设置多个变量来对多糖结合疫苗的关键参数进行筛选，无需经过多次实验来对多糖结合疫苗进行检测，进而获取最佳实验结果，相当于将单一变量实验变成了正交实验，通过检测吸光度快速获取实验结果，节省了检测时间和投入物料，大大提高了疫苗研发效率。

技术特征：

1.一种多糖结合疫苗的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的多糖结合疫苗的快速检测方法，其特征在于，所述在所述试剂盒中加入连接剂进行反应，使所述试剂盒中的多糖上具有裸露的氨基的步骤，包括：

3.根据权利要求2所述的多糖结合疫苗的快速检测方法，其特征在于，所述连接剂为己二酸二酰肼，所述连接剂与所述试剂盒中的多糖的质量比为(4-5)：1。

4.根据权利要求1所述的多糖结合疫苗的快速检测方法，其特征在于，所述加入乙醇和氯化钠，于2℃-8℃下保存，再离心，去除上清，得到含多糖衍生物的试剂盒的步骤，包括：

5.根据权利要求1所述的多糖结合疫苗的快速检测方法，其特征在于，所述显色剂为三硝基苯磺酸。

6.根据权利要求5所述的多糖结合疫苗的快速检测方法，其特征在于，所述在所述含多糖衍生物的试剂盒中加入显色剂进行显色反应的步骤，包括：

7.根据权利要求1所述的多糖结合疫苗的快速检测方法，其特征在于，所述通过紫外分光光度法测定所述含多糖衍生物的试剂盒中各个孔中溶液的吸光度值，计算得出反应收率的步骤，包括：

8.根据权利要求1所述的多糖结合疫苗的快速检测方法，其特征在于，所述多孔板为96孔板。

9.根据权利要求1所述的多糖结合疫苗的快速检测方法，其特征在于，所述反应试剂包括n-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐。

10.一种多糖结合疫苗的快速检测试剂盒，其特征在于，包括96孔板，所述96孔板的各个孔中装填有不同类型和不同分子量的多糖，且所述96孔板的各个孔中ph值不同，所述96孔板的各个孔中还装填有不同反应倍数的反应溶剂。

技术总结
本申请公开了一种多糖结合疫苗的快速检测方法及试剂盒，涉及疫苗检测技术领域。一种多糖结合疫苗的快速检测方法，包括以下步骤：选取不同类型的多糖并分别解聚成不同分子量，得到待反应的多糖溶液；将待反应的多糖溶液分别加入多孔板的孔中，并分别加入不同倍数的反应试剂，分别调节多孔板的各个孔中溶液的pH值，再冻干保存，得到试剂盒；在试剂盒中加入连接剂，使试剂盒中的多糖上具有裸露的氨基，再加入乙醇和氯化钠，于2℃‑8℃下保存，再离心，去除上清，得到含多糖衍生物的试剂盒；再加入显色剂进行显色反应，通过紫外分光光度法测定含多糖衍生物的试剂盒中各个孔中溶液的吸光度值，计算得出反应收率，完成检测。

技术研发人员：姚永鹏,黄杰,魏鑫,许可,张子昌,朱慧
受保护的技术使用者：成都康华生物制品股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17