一种高通量快速检测和评估化合物骨骼肌毒性的方法与流程

本发明涉及一种检测和评估化合物骨骼肌毒性的方法，尤其涉及一种高通量快速检测和评估化合物骨骼肌毒性的方法。

背景技术：

1、骨骼肌是执行机体运动的主要器官，也是机体能量代谢的重要器官。许多有毒有害污染物如肉毒素等以骨骼肌为损伤靶点，骨骼肌毒性也是许多药物比如麻醉剂、降脂药他汀、免疫治疗剂pd-1抑制剂等的常见不良反应。因此，识别及评估骨骼肌毒性对保护生命健康和降低药物开发成本有重要意义。

2、目前尚无公认的检测和评估骨骼肌毒性的方法，也无成熟的肌肉毒性动物模型。在肌肉毒性研究中，一般采用肌肉注射甘油的方式进行肌肉损伤造模，但这种方法模拟的是肌肉的机械损伤，无法反映化合物暴露后的肌肉化学性损伤。此外，该方法存在着动物实验固有的成本高、周期长、无法定量和批量检测的缺陷。并且，目前也尚无肌肉毒性的体外测试法方法，这种缺乏成熟筛查方法的现状严重阻碍了肌肉毒性评估以及后续毒性控制工作的定量化和标准化，亟需建立一套肌肉毒性的高通量快速定量评估体系。

3、骨骼肌的主要生理功能是肌肉的舒张和收缩，而骨骼肌的兴奋收缩耦联是舒张和收缩功能的分子基础。在骨骼肌中，钙离子通道ryr1(ryanodine receptor 1)直接参与了骨骼肌细胞兴奋收缩耦联。兴奋传递至骨骼肌肌膜，通过t管传导到细胞深处，触发终池l型钙通道的激活，进而激活肌浆网ryr1释放ca2+进入细胞浆，产生兴奋-收缩偶联(du等，2002，pnas，99:26)。ryr1异常影响肌细胞钙离子的释放和摄取，造成骨骼肌的收缩功能障碍。研究已证实ryr1的结构及功能异常与重症肌无力、中央轴空病、恶性高热、横纹肌溶解症等骨骼肌功能障碍相关疾病发生密切相关(brennan等,2019，human molecular genetics，28:18；voermans等，2016，revue neurologique，172：10)，ryr1是诊断骨骼肌损伤的生物标志。因此，ryr1通道状态可以指征骨骼肌损伤与否。

4、目前，监测ryr1的方法一般是[3h]ryanodine同位素结合实验和基于膜片钳的钙流实验。[3h]ryanodine同位素结合试验根据低浓度ryanodine与ryr1高亲和性结合且不改变ryr1通道功能的特性，用[3h]ryanodine与ryr1的结合水平反映ryr1功能状态。该方法已广泛应用于ryr1的功能研究，但是实验涉及同位素，存在实验人员的健康隐患，且实验需过夜，耗时长。膜片钳技术是研究离子通道的“金标准”，它通过测量离子通道的离子电流来反映细胞膜单一或多个离子通道的分子活动。膜片钳技术对仪器和人员操作要求较高，费用昂贵，无法进行大规模的筛选。并且，上述两种技术均需在分离纯化的ryr1或肌浆网上进行，实验难度高。因此，开发高通量、快速、简便、低成本的骨骼肌毒素的发现和鉴别技术具有重要意义。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供一种以钙离子通道ryr1作为生物标志物，最大程度模拟体内骨骼肌运动功能的生理情况的高通量快速检测和评估化合物的骨骼肌毒性的方法。

2、技术方案：本发明的一种高通量快速检测和评估化合物骨骼肌毒性的方法，以骨骼肌特异的钙离子通道ryr1作为生物标志物，通过稳定表达ryr1的细胞系与钙敏感荧光探针，针对能够诱导钙离子通道ryr1激活，并导致稳定表达ryr1细胞内钙离子增加的化合物进行筛选并鉴定，进而检测评估该化合物的骨骼肌毒性。

3、其中，所述方法为直接激动或二次激动：所述直接激动，采用稳定表达ryr1的细胞系接种铺板，加入钙离子染料孵育，加入待测化合物及阳性对照、溶剂对照和阴性对照并检测实时荧光；所述二次激动：采用稳定表达ryr1的细胞系接种铺板，加入钙离子染料孵育，加入待测化合物预刺激后，再次加入待测化合物并检测实时荧光。

4、其中，所述检测实时荧光，荧光信号激发波长为470～495nm，测定波长为515～575nm，以1～10s为间隔，检测荧光信号600～800次。

5、其中，所述直接激动，加入待测化合物的时间为开始检测的20～60s，以1s为检测间隔。

6、其中，所述二次激动，在加入待测化合物预刺激时，以1s为检测间隔，预刺激300～350s后再次加入待测化合物时，以1～10s为检测间隔。

7、其中，所述稳定表达ryr1的细胞系为过表达ryr1的细胞系包括质粒转染或慢病毒感染得到的稳定表达ryr1的工具细胞。

8、其中，所述稳定表达ryr1的细胞系为稳定表达ryr1的hek293细胞系。

9、其中，阳性对照为咖啡因(caffeine)，阴性对照为hank's平衡盐溶液(hank'sbalanced salt solution，hbss)，溶剂对照为含待测化合物溶剂的hbss，溶剂化物包括二甲基亚砜、hbss、生理盐水、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，pbs)中的一种或多种。

10、发明原理：本发明以实时监测钙离子浓度为原理的荧光快速检测方法，在稳定表达ryr1离子通道蛋白的hek293细胞基础上，利用钙离子荧光染料，优化实验条件，建立了实时监测钙离子通道ryr1的荧光筛查技术。通过监测ryr1功能状态筛查具有骨骼肌毒性的毒素，快速进行激动剂和抑制剂初筛，获得激动/抑制曲线，为骨骼肌毒素的低成本快速筛查和评估提供策略。

11、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明所述的通过ryr1筛查肌肉毒素的方法，与现有肌肉毒性的检测方法相比，灵敏度高、耗时短、成本低，为药物开发的肌肉毒性不良反应和化合物肌肉毒性监控提供快速筛查手段，具有良好的开发前景。

技术特征：

1.一种高通量快速检测评估化合物骨骼肌毒性的方法，其特征在于，所述方法以骨骼肌特异的钙离子通道ryr1作为靶点，通过稳定表达ryr1的细胞系与钙敏感荧光探针，针对能够诱导钙离子通道ryr1激活，并导致稳定表达ryr1细胞内钙离子增加的化合物进行筛选并鉴定，进而检测评估该化合物的骨骼肌毒性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法为直接激动或二次激动。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述直接激动，采用稳定表达ryr1的细胞系接种铺板，加入钙离子染料孵育，加入待测化合物及阳性对照、溶剂对照和阴性对照并检测实时荧光；所述二次激动，采用稳定表达ryr1的细胞系接种铺板，加入钙离子染料孵育，加入待测化合物预刺激后，再次加入待测化合物并检测实时荧光。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述检测实时荧光，荧光信号激发波长为470～495nm，测定波长为515～575nm，检测荧光信号600～800次。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述直接激动，加入待测化合物的时间为开始检测的20～60s。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述二次激动，加入待测化合物进行预刺激300～350s后，再次加入待测化合物，以1～10s为检测间隔。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稳定表达ryr1的细胞系为过表达ryr1的细胞系包括质粒转染或慢病毒感染得到的稳定表达ryr1的工具细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述稳定表达ryr1的细胞系为稳定表达ryr1的hek293细胞系。

技术总结
本发明公开了一种高通量快速检测和评估化合物骨骼肌毒性的方法，以骨骼肌特异的钙离子通道RYR1作为靶点，通过稳定表达RYR1的细胞系与钙敏感荧光探针结合，针对能够诱导钙离子通道RYR1激活，并导致稳定表达RYR1细胞内钙离子增加的化合物进行筛选并鉴定，进而检测评估该化合物的骨骼肌毒性；与现有肌肉毒性的检测方法相比，灵敏度高、耗时短、成本低，为药物开发的肌肉毒性不良反应和化合物肌肉毒性监控提供快速筛查手段，具有良好的开发前景。

技术研发人员：张驰,杨淼,吴肖肖,强雨薇,纪晗旭,杨佳欣,梅秀明,李雨枫,蒋迪尧,徐婧婧,王灿,查莉
受保护的技术使用者：南京市产品质量监督检验院（南京市质量发展与先进技术应用研究院）
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25