一种HBc-IgM抗体检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及体外诊断，具体是一种hbc-igm抗体检测试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、乙肝病毒（hbv）感染人体后，乙肝核心抗原（hbcag）刺激肝细胞产生抗体，主要包括hbc-igm和hbc-igg。hbc-igm在人体感染乙肝病毒后一周左右出现，是血液中最早出现的特异性抗体，随着病程的延长或者病情的好转，hbc-igm慢慢消失。hbc-igg是乙肝病毒既往感染的标志，具有流行病学调查意义。有研究显示，我国全年龄段不同地区hbcab阳性率在25%-40%之间。

2、hbc-igm作为是机体感染乙肝病毒后在血液中最早出现的特异性抗体，是乙肝表面抗原（hbsag）窗口期时检测的重要手段。hbc-igm的检测水平比hbeag/hbeab系统更能反映机体hbv-dna复制水平，是乙型肝炎病毒复制的一种可靠指标，常常提示为急性hbv感染，或者在慢性乙肝急性发作、慢性乙肝进入活动期，以确定乙肝病毒是否在复制，是否具有传染性。

3、目前判断乙肝病毒复制的常用手段是hbv-dna检测，但需要依赖设备、操作要求高且较易产生污染、检测周期长。hbc-igm作为乙肝病毒复制的另一重要标志物，目前商品化的检测试剂已有十几家，但具体方法学主要是集中在化学发光平台。胶体金平台检测的仍为hbcab总抗体，不能很好的区分是急性感染还是既往感染。因此，建立快速准确的hbc-igm诊断方法，一方面可有效降低hbsag窗口期时带来的隐形感染风险，另一方面可作为自测otc试剂确定慢性乙肝的急性发作或活动期。

4、目前国内已有专利涉及侧向免疫层析法检测hbc-igm抗体，其标记物为胶体金。胶体金具有等离子体特性，其颗粒小、制备需高温沸腾、原材料价格昂贵，作为标记物使用往往灵敏度低且成本高。与胶体金相比，胶体硒作为非金属胶体颗粒具有对电解质不敏感、常温制备、方法简单、原材料成本低等优点，已经逐渐被应用于侧向免疫层析试剂。然而胶体硒由于粒径小、分散性差等缺点，这些年发展缓慢，应用并不广泛。因此，急需制备一种粒径大、成本低、分散性好的纳米颗粒应用于侧向免疫层析平台以提高检测灵敏度。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种hbc-igm抗体检测试剂盒及其制备方法，采用硅芯硒壳纳米颗粒作为标记物，制备成本低，检测灵敏度高。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种hbc-igm抗体检测试剂盒的制备方法，包括标记垫的制备方法，标记垫的制备方法为：将hbcag-硅芯硒壳标记物和dnp-硅芯硒壳标记物按4:1体积比混合均匀后喷射于玻璃纤维sb08上，即得标记垫，hbcag-硅芯硒壳标记物和dnp-硅芯硒壳标记物均由硅芯硒壳纳米颗粒溶液作为示踪物标记制得。

3、hbcag-硅芯硒壳标记物的制备方法：取5ml硅芯硒壳纳米颗粒溶液，用0.1m碳酸钾调节ph至8.0；迅速加入0.8mg/ml hbc抗原，充分反应10min，加入终浓度1%的bsa，充分反应10min，10000rpm离心15min，5ml重悬液重悬得hbcag-硅芯硒壳标记物；

4、dnp-硅芯硒壳标记物的制备方法：取5ml硅芯硒壳纳米颗粒溶液，用0.1m碳酸钾调节ph至8.5；迅速加入1mg/ml dnp抗体，充分反应10min，加入终浓度1%的bsa，充分反应10min，10000rpm离心15min，5ml重悬液重悬得dnp-硅芯硒壳标记物；

5、所述的硅芯硒壳纳米颗粒溶液利用种子生长法，先对二氧化硅微球进行表面接枝改性，再在改性snps表面进行peg修饰，以peg修饰snps为硅芯种子，二氧化硒为生长液，在硅芯种子表面再生长硒壳层，制得核壳结构的硅芯硒壳纳米颗粒。

6、硅芯硒壳纳米颗粒溶液制备方法包括如下步骤：

7、s1、二氧化硅微球的制备：采用stober法制备二氧化硅微球，制备过程中，通过调控氨水浓度制得粒径110nm的二氧化硅微球，经hno3酸化、离心水洗，最终制得表面带正电荷的浓度为1mg/ml的二氧化硅微球。

8、s2、peg修饰二氧化硅微球溶液的制备：对s1制得的二氧化硅微球进行表面接枝改性，丁二酸酐作为改性剂，进行表面羧基功能基团化，得羧基化二氧化硅微球。取10ml羧基化二氧化硅微球，加入10ml peg溶液，常温条件下以500rpm高速搅拌30min，超声分散10min，离心水洗3次，10ml超纯水重悬得peg修饰二氧化硅微球溶液。

9、s3、硅芯硒壳纳米颗粒溶液的制备：取50ml超纯水置于100ml烧杯中，加入0.2%阿拉伯胶、1% pvp作为稳定剂，搅拌溶解；加入s2制得的peg修饰二氧化硅微球溶液10ml作为硅芯种子，加入0.3m二氧化硒10ml作为生长液，加入抗坏血酸10ml作为还原剂，常温条件下100rpm搅拌反应30min，使得胶体硒聚集在微球表面形成硒壳，离心水洗3次，10ml超纯水重悬得硅芯硒壳纳米颗粒溶液，4℃冰箱内保存待用。

10、硅芯硒壳纳米颗粒的粒径为150-200nm。

11、作为一种优化方案，所述peg溶液浓度为0.5%-1.5%；

12、作为一种优化方案，所述抗坏血酸的浓度为0.6-1.5m；

13、作为一种优化方案，一种hbc-igm抗体检测试剂盒的制备方法，还包括固相反应膜的制备方法，固相反应膜的制备方法为：分别将鼠抗人igm抗体和dnp-bsa为检测t线和质控c线包被于nc膜；

14、作为一种优化方案，一种hbc-igm抗体检测试剂盒的制备方法制备的试剂盒，包括测试条，测试条包括pvc板，pvc板上从左到右依次设有吸水纸、固相反应膜、标记垫、样品垫。

15、本发明采取以上技术方案，具有以下优点：本发明标记物为一种粒径为150-200nm的硅芯硒壳纳米颗粒，制备无需昂贵的氯化金原材料和繁琐的高温沸腾制备步骤，相比传统的胶体金颗粒，制备成本低。二氧化硅微球外层包覆一层硒壳，增加了纳米颗粒的粒径和表面积，使得纳米颗粒表面有更多的位点与标记蛋白结合，提高标记蛋白标记固化率，从而提高与包被抗体的结合力，相比传统的胶体硒标记，检测灵敏度更高。

16、本发明硅芯硒壳纳米颗粒的制备及应用，是本试剂盒提高灵敏度的关键技术之一。制备的二氧化硅微球首先进行酸化，无数正电荷形成的电荷层使得微球稳定、均匀的分布于溶剂中。对二氧化硅微球进行羧基化修饰，使得peg与二氧化硅微球结合更加牢固、致密，在二氧化硅微球表面形成一层peg非免疫致密层。peg非免疫致密层的引入，在增强二氧化硅胶体稳定性的同时还可以控制胶体硒的生长速度，提高胶体硒的结合效率。通过控制硒生长液和抗坏血酸的比例，调节硒在二氧化硅微球表面的生长速度及覆盖量，从而调控硅芯硒壳颗粒的形状、粒径及分散性。

17、下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

技术特征：

1.一种hbc-igm抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括标记垫的制备方法，标记垫的制备方法为：将hbcag-硅芯硒壳标记物和dnp-硅芯硒壳标记物按4:1体积比混合均匀后喷射于玻璃纤维sb08上，即得标记垫，hbcag-硅芯硒壳标记物和dnp-硅芯硒壳标记物均由硅芯硒壳纳米颗粒溶液作为示踪物标记制得。

2.根据权利要求1所述的一种hbc-igm抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述hbcag-硅芯硒壳标记物的制备方法：取5ml硅芯硒壳纳米颗粒溶液，用0.1m碳酸钾调节ph至8.0；迅速加入0.8mg/ml hbc抗原，充分反应10min，加入终浓度1%的bsa，充分反应10min，10000rpm离心15min，5ml重悬液重悬得hbcag-硅芯硒壳标记物。

3.根据权利要求2所述的一种hbc-igm抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述dnp-硅芯硒壳标记物的制备方法：取5ml硅芯硒壳纳米颗粒溶液，用0.1m碳酸钾调节ph至8.5；迅速加入1mg/ml dnp抗体，充分反应10min，加入终浓度1%的bsa，充分反应10min，10000rpm离心15min，5ml重悬液重悬得dnp-硅芯硒壳标记物。

4.根据权利要求3所述的一种hbc-igm抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述硅芯硒壳纳米颗粒溶液利用种子生长法，先对二氧化硅微球进行表面接枝改性，再在改性snps表面进行peg修饰，以peg修饰snps为硅芯种子，二氧化硒为生长液，在硅芯种子表面再生长硒壳层，制得核壳结构的硅芯硒壳纳米颗粒。

5.根据权利要求4所述的一种hbc-igm抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述硅芯硒壳纳米颗粒溶液制备方法包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的一种hbc-igm抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述硅芯硒壳纳米颗粒的粒径为150-200nm。

7.根据权利要求6所述的一种hbc-igm抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述peg溶液浓度为0.5%-1.5%。

8.根据权利要求7所述的一种hbc-igm抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述抗坏血酸的浓度为0.6-1.5m。

9.根据权利要求1-8其中之一所述的一种hbc-igm抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：还包括固相反应膜的制备方法，固相反应膜的制备方法为：分别将鼠抗人igm抗体和dnp-bsa为检测t线和质控c线包被于nc膜。

10.根据权利要求9所述的一种hbc-igm抗体检测试剂盒的制备方法制备的试剂盒，其特征在于：包括测试条，测试条包括pvc板，pvc板上从左到右依次设有吸水纸、固相反应膜、标记垫、样品垫。

技术总结
本发明涉及一种HBc‑IgM抗体检测试剂盒及其制备方法，涉及体外诊断技术领域，HBc‑IgM抗体检测试剂盒的制备方法包括标记垫的制备方法，标记垫的制备方法为：将HBcAg‑硅芯硒壳标记物和DNP‑硅芯硒壳标记物按4:1体积比混合均匀后喷射于玻璃纤维SB08上，即得标记垫，本发明采用硅芯硒壳纳米颗粒作为标记物，制备成本低，检测灵敏度高。

技术研发人员：曹传美,张平,李桂芹,杨帆,杨致亭,张静静,杨明霞
受保护的技术使用者：山东康华生物医疗科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19