一种基于级联信号放大策略的时间免疫分析方法

本申请涉及生物，具体涉及一种基于级联信号放大策略的时间免疫分析方法。

背景技术：

1、酪胺信号放大系统(tsa)是一种酶介导的放大方法，tsa可以使固相免疫测定和免疫组化中的信号呈几何级的放大。tsa原理是使辣根过氧化物酶(hrp)在过氧化氢存在下催化生物素基酪胺分子的酚羟基基团形成自由基中间体，该中间体能迅速以共价键结合到信号放大位点附近的蛋白质残基上(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)，形成二聚体，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的生物素沉积或固定。

2、生物素-亲和素系统(bas)是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，结合二者即可偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，它们的结合迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。自bas开始应用于免疫化学领域以来，利用bas可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记的特点而发展和建立了许多新的检测方法和技术，尤其是与免疫标记技术的有机结合，极大地提高了测定的灵敏度。

3、放射免疫分析法(ria)这一分析技术由于存在放射污染、半衰期短、有效期短等缺陷而即将被淘汰。化学发光免疫分析法(clia)因发光时间短而不能重复检测，易受环境物质干扰，且试剂价格昂贵，无法广泛使用。酶联免疫分析(elisa)利用酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催化的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度，但相对其酶活性和显色底物的稳定性有待提高。

4、时间分辨免疫分析(trfia)是一种非放射性免疫检测技术。其主要特点是以稀土元素为示踪剂，再使用时间分辨荧光测量法排除非特异性荧光的干扰，最大限度地提高了灵敏度。其本底低，稳定性好，线性范围宽，是目前公认的最有发展前途的非放射性免疫标记技术

5、时间分辨免疫分析具有许多优秀的特点，比如所利用的稀土纳米材料具有性质稳定，比表面积大，可修饰性强，合成成本低廉等优点，是目前普遍看好的新一代荧光生物标记材料。但稀土纳米材料的发光是通过稀土离子4f组态电子间跃迁吸收敏化发光，摩尔消光系数小，发光弱。以稀土纳米材料作为标记物的直接检测，灵敏度较低而限制了其应用。如何提高检测的灵敏度，成为当前在相关领域亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题之一在于，提供一种信号放大方法，能够大幅度增强时间分辨荧光免疫分析的灵敏度。

2、本发明所要解决的技术问题之二在于，提供一种具体的生物分子应用，能够很好的实现信号放大的目的。

3、本发明提供如下技术方案：

4、一种用于时间分辨荧光免疫分析方法(trfia)的信号放大方法，所述信号放大策略是基于酪胺放大系统与酶联免疫相结合。

5、在一个具体的实施方式中，通过生物素基酪胺作为酪胺放大系统中的生物分子。

6、在一个具体的实施方式中，通过生物素基酪胺作为酪胺放大系统中的生物分子，通过酶联免疫中酶的催化作用来实现酪胺的信号放大功能。

7、在一个具体的实施方式中，通过生物素基酪胺作为酪胺放大系统中的生物分子，通过稀土配合物偶联的亲和素，来实现生物素与亲和素的特异性结合，用于后续时间分辨荧光的检测。

8、根据本发明，所述方法的具体步骤如下：

9、1)将捕获抗体以物理吸附或共价偶联的方式固定在微孔板上；

10、2)封闭液封闭；

11、3)加入含有待测抗原的样品；

12、4)加入被酶标记的能够与抗原特异性结合的抗体，形成免疫复合物；

13、5)加入生物素基酪胺偶联物，进一步形成复合物；

14、6)加入稀土配合物标记的亲和素，与生物素发生结合；

15、7)加入增强液，采用时间分辨检测荧光信号。

16、其中，所述标记抗体的酶为辣根过氧化物酶。

17、在一个具体的实施方式中，所述稀土配合物标记的亲和素，主要为铕配合物标记的链霉亲和素，可通过商购得到。

18、其中稀土材料含有铕、钐、铽、镝中的一种或多种。

19、优选含三价的铕离子的材料。

20、在一个具体的实施方式中，所述生物素基酪胺偶联物为酪胺放大系统中常用生物分子，可通过商购或自己合成，生物素与酪胺通过酰胺缩合反应结合在一起。

21、在一个具体的实施方式中，所述封闭液为本领域的常规溶液，可以通过商购或自行合成。

22、优选封闭液为体积分数为1％的牛血清白蛋白溶液。

23、在一个具体的实施方式中，所述的增强液可以为本领域常规的增强液，优选由缓冲液、β-二酮体，非离子表面活性剂和协同剂组成。

24、在一个具体的实施方式中，缓冲液选自triton x-100。

25、在一个具体的实施方式中，β-二酮体选自萘甲酸三氟丙酮。

26、在一个具体的实施方式中，非离子表面活性剂选自三正辛基氧膦。

27、在一个具体的实施方式中，协同剂选自蒸馏水。

28、在一个优选的实施方式中，增强液由triton x-100、萘甲酸三氟丙酮、三正辛基氧膦和蒸馏水组成

29、其中，本发明的检测模式为检测模式为夹心法检测、直接检测法或竞争检测法。

30、优选检测方法为夹心法检测。

31、本发明的有益效果在于：

32、1)采用酶联免疫方法来引入酶，充分利用了免疫分析的特异性与酶促反应的高效性和专一性，使得检测的效率和精准度大幅增加。

33、2)采用生物素基酪胺进行信号放大，充分利用了引入的酶的催化作用，使得后续测定的生物素数量呈几何级放大。

34、3)采用稀土配合物标记的亲和素，亲和素与生物素相结合形成复合物，这样用于后续检测的稀土配合物的量相较于传统的检测方法有了成倍的增加。本发明的检测灵敏度双抗夹心法elisa标准测定方法高105倍。比传统时间分辨荧光免疫分析高106倍。

技术特征：

1.一种基于级联信号放大策略的时间免疫分析的生物分子，其特征在于，所述生物分子包括酪胺、生物素、亲和素、抗体以及稀土材料。

2.根据权利要求1的所述生物分子，其特征在于，所述稀土材料含有铕、钐、铽、镝中的一种或多种；优选地，所述稀土材料含有三价的铕离子。

3.根据权利要求1所述的生物分子，其具体结构为稀土离子标记的亲和素-生物素基酪胺复合物。

4.一种基于级联信号放大策略的时间免疫分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记抗体的酶为辣根过氧化物酶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的增强剂由缓冲液、β-二酮体，非离子表面活性剂和协同剂组成。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的增强剂由triton x-100、萘甲酸三氟丙酮、三正辛基氧膦和蒸馏水组成。

8.根据权利要求1所述方法，其检测模式为夹心法检测、直接检测法或竞争检测法。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

10.根据权利要求6的方法，其特征在于，所述封闭液为1％的牛血清白蛋白溶液。

技术总结
本发明涉及一种基于级联信号放大策略的时间免疫分析方法。酶催化具有高效性、专一性，采用酶标记抗体，在H<subgt;2</subgt;O<subgt;2</subgt;存在时，酶将生物素基酪胺偶合物中的酪胺上的部分位点活化，形成共价结合位点与周围物质进行聚集、偶联形成复合物，使得大量的生物素沉积，用于后续反应的生物素成倍增加。然后加入稀土配合物标记的亲和素，通过亲和素与生物素相互作用使得用于后续检测信号的稀土离子大幅增加，极大地提高了稀土离子的利用率。最后加入增强剂，采用时间分辨检测荧光信号，提高了时间分辨荧光的检测灵敏度。

技术研发人员：许苏英,路振龙,汪乐余
受保护的技术使用者：北京化工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/24