一种用于肉毒杆菌神经毒素A检测的生物传感器及其构建方法和应用

本发明涉及一种用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器及其构建方法，还涉及一种所述传感器配合商业化早孕试纸实现肉毒杆菌神经毒素a检测方法，属于生物传感。

背景技术：

1、肉毒杆菌神经毒素(bonts)是肉毒杆菌在繁殖过程中分泌的一种毒性蛋白质。依其毒性和抗原性不同，分为a、b、c、d、e、f、g、x8个亚型。目前，主要是a、b型被开发进入商业化运用，其中a型效力最强。因在临床中发现，肉毒杆菌神经毒素在消除皱纹方面具有显著的功效。很快，注射肉毒杆菌神经毒素的美容手术应运而生，并迅速风靡全球。然而由于神经毒性强烈，肉毒杆菌神经毒素产品在各个国家均按照药品标准受到严格管控。《柳叶刀》1978年刊登的一项研究数据显示，a型肉毒素对人类的致死剂量为1纳克(约2000～3000个单位)/千克体重。因此临床上迫切需要开发快速、准确的检测肉毒杆菌神经毒素的方法。

2、目前小鼠生物检测法仍然是检测肉毒杆菌神经毒素的金标准，但存在耗时(4～6天)及费用高等问题。因此，开发一种操作处理简单，选择性好，灵敏度高，成本低廉的肉毒杆菌神经毒素检测方法具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有检测肉毒杆菌神经毒素的方法存在的不足，本发明的目的是在于提供一种用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器，该生物传感器为fe3o4-peptide-hcg复合物，利用特殊的多肽链将hcg固定在磁珠表面，而多肽链可以被肉毒杆菌神经毒素a切割释放hcg分子，从而可以利用商业早孕试纸来检测肉毒杆菌神经毒素a。

2、本发明的第二个目的是在于提供一种用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器的构建方法，该方法简单，成本低，操作方便，有利于扩大生产。

3、本发明的第三个目的是在于提供一种肉毒杆菌神经毒素a的检测方法，该方法利用fe3o4-peptide-hcg复合物配合商业化早孕试纸实现，具有选择性好、灵敏度高、操作简单方便、成本低等优点，可以实现肉毒杆菌神经毒素a的定量分析。

4、为了实现上述技术目的，本发明提供了一种用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器，其包括fe3o4-peptide-hcg复合物；所述fe3o4-peptide-hcg复合物由hcg通过多肽链修饰在fe3o4磁珠上构成；所述多肽链序列为csnktr idqanqratkmlk。

5、本发明用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器为fe3o4-peptide-hcg复合物。其设计原理主要是：hcg能够使得商业早孕试纸变色，同时设计特殊的多肽链序列csnktridqanqratkmlk，其能够被肉毒杆菌神经毒素a切割，且对检测过程没有干扰。基于此，先在磁珠表面修饰特殊的多肽链，而再利用多肽链的自由端修饰hcg分子，而在肉毒杆菌神经毒素a存在下，肉毒杆菌神经毒素a可以将多肽链切割，释放固定在磁珠表面的hcg，此时通过磁铁将磁珠分离后，溶液中的hcg使早孕试纸显色，而当没有肉毒杆菌神经毒素a存在时，hcg固定在磁珠上而未被释放，将磁珠分离后，溶液中不含hcg分子，所以早孕试纸不会显色。由此，可以实现肉毒杆菌神经毒素a的检测，并且溶液中肉毒杆菌神经毒素a的含量与释放的hcg量呈现正比关系，通过检测hcg含量的高低可以实现肉毒杆菌神经毒素a的定量分析。

6、本发明还提供了一种用于肉毒杆菌神经毒素a检测的生物传感器的构建方法，其包括以下步骤：

7、1)将表面带氨基的磁珠、戊二醛及硫氰酸钾在溶液中混合孵育i，得到表面氨基活化的磁珠；

8、2)将表面氨基活化的磁珠与多肽进行缩合反应，得到多肽修饰的磁珠；所述多肽一端修饰巯基一端修饰氨基；

9、3)将多肽修饰的磁珠与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐进行反应i，得到反应液i；同时，将hcg溶液与4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液进行反应ii，得到反应液ii；将反应液i和反应液ii混合孵育ii，磁选分离，即得fe3o4-peptide-hcg复合物。

10、本发明提供的fe3o4-peptide-hcg复合物的制备方法，该方法利用磁珠来作为载体，一方面，有利于磁珠从溶液中分离，另外一方面，能提高多肽及hcg在磁珠表面的负载量，提高检测灵敏度。利用的多肽其一端修饰有氨基，另一端修饰有巯基，磁珠表面的氨基与多肽上的氨基可以通过戊二醛缩合，从而实现交联，能够将多肽修饰在磁珠表面，而多肽另一端的巯基与hcg分子上的氨基通过smcc交联，而多肽能够响应肉毒杆菌神经毒素a从而释放hcg，从而构建肉毒杆菌神经毒素a的生物传感器。

11、作为一个优选的方案，所述孵育i的条件为：在室温下，孵育2～3小时。通过孵育能够将磁珠表面的氨基与戊二醛发生缩合，从而得到醛基修饰的磁珠。

12、作为一个优选的方案，所述缩合反应的条件为：在室温下，反应6～8小时。通过缩合反应可以将多肽通过化学键合至磁珠表面。

13、作为一个优选的方案，所述反应i的条件为：在室温下，反应1～2小时。该反应主要是将多肽上的巯基活化。

14、作为一个优选的方案，所述反应ii的条件为：在在室温下，反应30～60min。该反应主要是将hcg分子上的氨基活化。

15、作为一个优选的方案，所述孵育ii的条件为：在0～5℃，反应8～12小时。孵育过程能够将活化的巯基和活化的氨基进行缩合反应。

16、作为一个优选的方案，所述多肽链序列为hs-csnktridqanqra tkmlk-nh2(于生工生物工程(上海)股份有限公司购得)。

17、作为一个优选的方案，步骤1)中，所述磁珠在溶液中的浓度为2～5mg/ml。磁珠的浓度过小将导致负载的hcg量偏少，影响检测灵敏度。而磁珠浓度过大一方面会影响多肽和hcg在磁珠表面的负载效率，另一方面也会影响到肉毒杆菌神经毒素a切割多肽的效率，进而影响检测灵敏度。

18、本发明还提供了一种肉毒杆菌神经毒素a检测的方法，该方法是将肉毒杆菌神经毒素a溶液与含所述fe3o4-peptide-hcg复合物的溶液混合反应后，磁选分离，反应液采用商用早孕试纸检测。

19、作为一个优选的方案，所述反应的条件为在20～40℃，反应2～3小时。

20、作为一个优选的方案，采用商用早孕试纸检测反应液的过程为：将早孕试纸浸入反应液中5～20分钟后，取出并早孕试纸拍照并用imagej软件分析试纸显色强度。

21、作为一个优选的方案，根据早孕试纸测试线颜色深浅肉眼判断肉毒杆菌神经毒素a浓度大小，颜色越深，肉毒杆菌神经毒素a的浓度越大；或者，通过imagej软件分析颜色深浅，实现肉毒杆菌神经毒素a定量检测。

22、本发明的fe3o4-peptide-hcg复合物用于检测肉毒杆菌神经毒素a的方法：

23、1)将不同浓度的肉毒杆菌神经毒素a溶液与fe3o4-peptide-hcg复合物孵育，用磁铁将磁珠分离后，将早孕试纸浸入溶液中反应，随后将试纸拍照并用imagej软件分析试纸显色强度，根据颜色强度与肉毒杆菌神经毒素a浓度绘制标准曲线。

24、2)将实际血清样本与fe3o4-peptide-hcg复合物孵育，用磁铁将磁珠分离后，将早孕试纸浸入溶液中反应，随后将试纸拍照并用imagej软件分析试纸显色强度，通过颜色强度从标准曲线中得到肉毒杆菌神经毒素a浓度。

25、与现有技术相比，本发明技术方案的优点在于：

26、(1)本发明的fe3o4-peptide-hcg复合物利用磁球负载多肽及hcg分子，磁球易于通过磁选从溶液中分离，同时磁球大的比表面积能提高多肽及hcg分子负载量，提高检测灵敏度。

27、(2)本发明的fe3o4-peptide-hcg复合物可以配合成熟的商业化早孕试纸实现肉毒杆菌神经毒素a的检测，通过image j软件定量颜色强度实现定量检测，操作简单，成本低，灵敏度高。

28、(3)本发明的fe3o4-peptide-hcg复合物基于磁球及早孕试纸的传感方法可推广用于其它可以水解多肽、dna链的酶或其它物质的检测。

29、(4)本发明的fe3o4-peptide-hcg复合物制备方法简单，成本低，有利于工业化生产。