一种基于Mxene原位生长纳米颗粒的电化学传感器制备方法

本本发明涉及一种基于mxene原位生长纳米颗粒的电化学传感器的制备方法及应用。

背景技术：

1、中国是第一个在食用动物中使用抗生素的国家，并且是世界上最大的抗生素生产国和消费国。2013年，四环素(tet)在全球抗生素生产和使用中排名第二，是我国生产最多、使用最频繁的一类抗生素。四环素残留会严重影响人体健康，长期食用含有抗生素残留的食品会对消费者的健康造成有毒和危险的影响，例如过敏反应、对微生物的抗药性、胎儿发育不良、肠胃不适。食物中抗生素最重要的副作用之一就是过敏反应，许多药物和抗生素均可引起过敏反应。因此，我们有必要开发有效的技术来检测、消除和控制四环素残留所带来的风险。

2、目前，针对四环素的检测主要采用色谱分析方法，包括液相色谱法、液相色谱串联质谱法和气相色谱串联质谱法，这些方法能够实现高灵敏度的检测。然而，这些方法的设备和技术操作要求较高，且样品处理复杂、耗时、成本较高，不适用于大规模的食品安全检测。因此需要建立一种灵敏度高、成本低、适用于快速检测的方法解决食品中四环素超标的问题。

3、电化学技术以其基础理论成熟、操作简单、检测过程快速等优点，在生物传感器分析中得到了广泛应用。但同时也存在灵敏度有限、抗干扰能力差的缺点。核酸适配体aptamer是一种通过指数富集配体系统进化技术筛选而来的，它对特定靶物质具有良好的识别能力，其特异性和亲和力与抗原和抗体相当，解离常数通常在纳摩尔和皮摩尔之间，并且具有结构简单、易于合成和修饰、特异性强、适应范围广、易于制备和储存等优势。因此可以将电化学生物传感器和适配体相结合，通过适配体的高特异性来提高电化学传感器的灵敏度，同时还可以通过dna放大技术和纳米材料来提高电化学传感器的灵敏度，通过加入目标物引起dna结构变化来反应电流信号。因此，本发明使用了多层金属复合材料和多种信号放大策相结合来检测四环素，相较于使用带有标记的dna做信号标签，本发明采用过渡金属mof负载亚甲基蓝mb作为信号标签降低了成本的同时还增加了电极的导电性，同时采用催化发夹自组装循环策略和触发靶向多dna释放两种信号放大技术，有效的提高了电化学传感器的灵敏度。

4、本发明针对现有检测技术存在的问题，提供了一种基于mxene原位生长纳米颗粒的电化学传感器，用于准确的检测食品中的四环素，采用磁分离技术，减小了假阳性信号的干扰；并且利用多层金属复合材料自身的还原性可以使更多的金属颗粒负载，增加电极导电性，起到信号放大的作用；同时采用催化发夹自主装策略和触发靶向多dna释放，实现信号的进一步扩增；并且使用mof材料负载信号标签亚甲基蓝，降低了成本。基于本发明的电化学传感器策略在克服了现在技术存在问题的时候，具有特异性强、成本低、稳定性好的特点，有利于发明的推广应用。

技术实现思路

1、一种基于mxene原位生长纳米颗粒的电化学传感器的制备方法，按照以下步骤进行：(1)金属mof复合材料的制备：采用一锅溶剂热法，将氯化锆溶于n,n-二甲基甲酰并超声混合，之后加入2-氨基对苯二甲酸和冰乙酸再次进行超声混合。将上述混合溶液转移到高压反应釜中过夜孵育，所得到的产物用n,n-二甲基甲酰和无水乙醇清洗未反应的溶剂，离心收集产物，真空干燥至恒重即得过渡金属mof。采用氧化还原法在上述纳米材料上原位生成贵金属纳米粒子，首先将上述纳米材料超声分散在水中,并加入贵金属溶液混合均匀，之后加入还原剂并充分搅拌，高速离心，干燥至恒重即得金属mof复合材料。

2、(2)金属mof复合材料表面修饰dna发夹hp2及信号标签：将上述制备好的金属mof复合材料分散在水中，并加入同体积的信号标签，将混合液在摇床上恒温震荡，离心洗涤为未结合的信号标签。之后加入dna发夹hp2，同样也在摇床上恒温震荡，离心洗涤未结合的dna发夹hp2，即得到表面修饰dna发夹hp2及信号标签的金属mof复合材料。

3、(3)mxene-au nps的制备：将碳化钛铝和氢氟酸在恒温下搅拌数小时后经水洗涤，直至上清液ph＞6，真空干燥得到多层材料，通过材料本身的还原性，加入贵金属溶液经恒温磁力搅拌后形成金属颗粒，经水洗涤后去除未结合的金属溶液，干燥得到mxene-au nps。

4、(4)四环素的测定：将多层金属复合材料通过物理吸附固定在金电极的表面，将硫基修饰的dna发夹hp1通过金-硫键固定在材料上，并用6-巯基-1-乙醇封闭活性位点，之后构建mbs@apt/s1/s2/s3体系，将有羧基标记的磁珠mbs和氨基修饰的适配体aptamer按比例混合过夜孵育，在目标物存在的情况下，诱导脱落下来的dna互补链s1、s2、s3混合液将会被添加到电极上将dna发夹hp1打开，形成双链，之后将金属mof复合材料修饰的dna发夹hp2及信号标签滴加到金电极上，由于dna互补链s1、s2、s3和hp1形成双链后有部分碱基暴露，从而可以将dna发夹hp2打开并且将dna互补链s1、s2、s3取代，游离的dna互补链s1、s2、s3将会继续进行cha循环，最终许多信号标签将会连接到电极表面。最后将电极放到缓冲溶液中，通过方波伏安法对电极进行检测，通过电流相应变化来确定四环素的含量。

5、进一步限定，步骤(1)中，所述的过夜孵育为10～12h；所述的贵金属溶液为四氯金酸、醋酸铑、四氯钯酸钠中的一种或多种；所述还原剂为硼氢化钠、抗坏血酸、柠檬酸盐中的一种或多种。

6、进一步限定，步骤(2)中，所述的信号标签为亚甲基蓝、二茂铁、硫堇中的一种或多种；所述的恒温震荡为30～37℃；所述的时间为2～6h。

7、进一步限定，步骤(3)中，所述的温度为35℃；所述的时间为24～36h；所述的贵金属溶液为四氯金酸、醋酸钯、硝酸银中的一种或多种。

8、进一步限定，步骤(3)中，所述的磁珠体积为1～5μl；所述的恒温振荡温度为20～50℃。

9、进一步限定，步骤(2)(4)中，所所述的的dna发夹hp1序列为5’-gct aga gat tttcgt gtc tga ctt ctc tag cgg gtt ttg ggt ttt agt cag aca cga aaa-3’其中3’端修饰有硫基；所所述的的dna发夹hp2序列为5’-aac ccg cta gag aag tca gac acg aaa atctct agc ggg ttt tgg gtt-3’其中3’端修饰有硫基；所述的适配体aptamer序列为：5’-cgtacg gaa ttc gct agc ccc ccg gca ggc cac ggc ttg ggt tgg tcc cac tgc gcg tggatc cga gct cca cgt g-3’其中5’端修饰氨基；所述的dna单链s1序列为：5’-cag tca gacacg aaa atc tct agc cac gtg gag ctc gga tcc a-3’；所述的dna单链s2序列为：5’-cagtca gac acg aaa atc tct agc gga cca acccaa gcc-3’；所述的dna单链s3序列为：5’-cag tca gac acg aaa atc tct agc cgg ggg gct agc gaa-3’。

10、进一步限定，步骤(2)(4)中所述的dan链的浓度为0.5～2μm；所用体积为5～10μl；孵育时间为0.5～2h。

11、与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

12、1.本发明利用适配体较长的优势互补了三条单链dna，在目标物存在的情况下触发靶向多dna释放，实现信号放大。

13、2.本发明成功制备了mxene-au nps和金属mof复合材料，实现了对传感器性能的优化。

14、3.本发明巧妙结合催化发夹自组装策略，将更多的信号标签连接到电极上，起到信号放大的作用。