一种乳中88种脂肪酸含量的测定方法及其应用

本发明涉及乳制品脂肪酸检测，特别是涉及一种乳中88种脂肪酸含量的测定方法及其应用。

背景技术：

1、脂肪酸（fa）是牛奶发挥营养功能的重要因子，其种类和组成影响人类健康。不同fa的功能存在差异，需要详细分析牛奶fa的种类和含量，为牛奶品质评价提供基础数据。乳脂是自然界中脂质组成最丰富的脂肪来源之一，乳脂等反刍动物源性脂质是人类膳食中短链脂肪酸（scfa）、共轭亚油酸（cla）和支链脂肪酸（bcfa）等的主要来源，该类fa在植物源性、单胃动物源性脂质几乎不存在。研究表明，牛奶中可能存在数百种fa，但牛奶中各fa丰度差异极大，仅约14种相对含量超过1%的fa，其余fa含量低。与其他食物或生物基质中fa的存在形式有所不同的是，乳脂被3层乳脂球膜包裹形成乳脂球，牛奶fa以结合态和游离态两种形式存在，约90%~99%的fa以甘油酯和磷脂等结合态形式存在，约1%~10%的fa以游离态的形式存在，在不同动物乳中的组成和分布存在较大差异。正是由于乳fa种类众多、丰度差异大、存在形式有别于其他基质，其他基质的fa测定方法应用于牛奶样品的fa测定存在技术难度，适用性有待进一步验证。针对牛奶fa测定，需要采取更为有效的针对性的测定方法，才能准确定量和定性牛奶中的总fa（游离和结合）。

2、目前关于乳中脂肪酸测定主要执行以下标准，国家标准《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》gb 5009.168-2016中关于食品中脂肪酸的检测仅针对37种fa，国际标准iso 16958:2015关于奶及奶粉中脂肪酸的检测仅针对36种fa。尽管已有研究报道提出牛奶理论上存在数百种fa，但从目前方法的通量和灵敏度看，牛奶中大部分含量相对较低的fa未能被定量，尤其是缺少对c1~c4等scfa和不饱和脂肪酸（ufa）的准确定量分析。scfa的前处理过程的挥发损失和ufa众多的同分异构体的色谱分辨率和检测灵敏度不足导致牛奶fa的检测通量较低，导致对牛奶fa的组成认识局限。

3、近年来，研究学者们围绕提高fa的检测通量和准确度方面做了不少尝试。一套完整的fa测定方法，包括样品前处理、仪器检测、定性定量分析三部分。保证目标fa在样品前处理过程充分提取、提高仪器的对目标fa的色谱分离度和检测灵敏度、选择合适的定量计算方式，是fa准确分析的关键。

4、目前，fa测定的前处理过程主要是两类技术思路，一是样品中的fa不经任何衍生处理，直接或经吹扫捕集装置吸附，随后进入气相色谱或液相色谱等仪器进行测定分析；二是样品中的fa经衍生后进入气相色谱等仪器进行测定分析。

5、第一类测定方法，由于未经衍生，仅能测定乳中游离fa，忽略了乳中结合态形式存在的fa的含量。

6、第二类测定方法，样品中的结合态和游离态的fa经过衍生，能增加fa的挥发性、改善色谱分辨率、提高检测灵敏度，定量测定总fa。但是对于高挥发性的scfa而言，减少并避免其在测定过程中的挥发损失对于fa准确定量十分关键。甲酯化是目前最常用的fa衍生化方式，用于c4~c24 fa的测定，对于c1~c4等scfa的测定，因其甲酯的高挥发性，产生不可避免的挥发损失，造成c1:0、c2:0和c3:0含量被低估。脂肪酸乙酯与脂肪酸甲酯也会出现类似的挥发损失的问题。此外，酯化试剂与目标物的共流出会造成scfa无法准确定量，如c3:0丙酯和丙醇共流出影响c3:0的定量，c4:0丁酯和丁醇共流出影响c4:0的定量，氯甲酸丙酯衍生过程中的副产物甲酸影响c1:0的定量。因此，当前fa测定的前处理过程的主要技术难题是如何同时提取乳中游离和结合态scfa，并将其酯化为分子量较高、挥发性较低且不与酯化试剂共流出的目标物。

7、另外，目前fa测定的所使用的仪器主要是气相色谱用于分离，氢火焰离子化检测器用于检测。但是牛奶fa种类众多、丰度差异大，尤其是ufa，众多的同分异构体理化性质相近导致色谱分辨率不足，以及氢火焰离子化检测器对牛奶中低丰度fa含量检测灵敏度不足，分辨率和灵敏度不足导致了牛奶fa检测通量较低，进而导致对牛奶fa的组成认识不全面。奇支链饱和脂肪酸（obcfa）与偶数链饱和脂肪酸（ecsfa）色谱共流出、ufa的同分异构体之间的色谱共流出是目前色谱分离过程中最常见的问题，但是氢火焰离子化检测器在无标准品的时候无法识别共流出，易产生定性错误。质谱因其具有高选择性和高灵敏度作为检测器用于物质定性和定量分析，有全扫描、选择离子扫描、多反应监测等多种扫描模式用于数据采集。当前质谱用于fa测定的主要技术难题是如何利用质谱的独特的扫描优势选择合适的定性定量离子，提高色谱分离度和检测灵敏度。

8、目前fa测定的定量计算经常采用外标法，但是由于fa测定涉及到的前处理过程步骤多，因操作和系统误差对定量结果的正确度影响较大，因此应当使用内标法定量计算fa测定的结果，用以校正误差。但是，目前常选用游离c11:0 fa作为内标，实际上牛奶中绝大部分是fa是以酯化形式存在的，而非游离fa；此外c11:0是存在于牛奶基质中的一种fa，这会造成fa定量计算的误差较大。因此，当前fa测定的定量计算中的主要技术难题之一是如何选择牛奶中不存在的且与目标fa性质相近的fa作为内标。

9、scfa的前处理过程的挥发损失、ufa众多的同分异构体的色谱分辨率和检测灵敏度不足导致牛奶fa的检测通量较低，导致对牛奶fa的组成认识局限，造成其检测范围仅限于scfa或中长链脂肪酸（mlcfa）的游离fa或结合fa。目前仍未找到一个有效的方法能准确高效的检测乳中c1~c24 fa（游离和结合）。

技术实现思路

1、针对现有检测方法中scfa挥发损失、fa检测范围窄通量低、fa检测碎片化等的缺陷，本发明提供了一种乳中88种脂肪酸含量的测定方法及其应用，该方法能快速、全面检测乳中总fa（游离和结合）含量。

2、本发明克服了scfa的前处理过程的挥发损失、ufa众多的同分异构体的色谱分辨率和检测灵敏度不足导致牛奶fa的检测通量较低且无法全面测定牛奶中游离和结合态fa含量的技术难题，针对乳中fa的存在形式以及不同碳链长度的fa的特点，建立一套乳中scfa（c1~c6）的异丙酯化和mlcfa（c7~c24）的甲酯化的衍生化方法，以异丙酯替代甲酯化减少scfa在样品前处理过程中的挥发损失并实现游离和结合scfa充分反应和衍生化，利用气相色谱质谱检测器的高选择性和高灵敏度，优化脂肪酸的色谱分离度和质谱扫描模式，提高目标脂肪酸酯的色谱分离和检测灵敏度，利用双内标法校正和消除前处理及仪器分析过程中产生的误差，提高分析结果的准确性，将fa的检测范围拓展到c1~c24总fa（游离和结合）。

3、本发明从线性、灵敏度、准确度、精密度和回收率等方面对上述乳中88种fa的测定方法进行了充分的验证，最终该方法可应用于乳及乳制品fa的含量检测，全面地解析乳中fa的含量及组成，为进一步探究乳中fa生理活性功能提供技术支撑，为指导乳品生产、加工和消费提供参考。

4、具体而言，本发明采用的技术方案具体如下：

5、一种乳中88种脂肪酸含量的测定方法，包括以下步骤：（1）脂质提取；（2）fa衍生化：将乳中scfa（c1~c6）进行异丙酯化，mlcfa（c7~c24）进行甲酯化；（3）fa衍生物提取；（4）气相色谱质谱（gc-ms）分析；（5）fa绝对含量和相对含量计算；

6、所述fa包括碳链长度1~24的fa，具体为12种偶数链饱和脂肪酸（ecsfa）、11种奇数链饱和脂肪酸（ocsfa）、13种支链饱和脂肪酸（bcsfa）、30种单不饱和脂肪酸（mufa）和22种多不饱和脂肪酸（pufa）。

7、其中，所述步骤（1）具体为，移取两份乳品试样，分别加入正己烷/异丙醇混合溶液，离心去除蛋白质，提取脂质；

8、其中一份乳品试样与正己烷/异丙酯混合溶液的体积比为1:3，除蛋白层之外的所有上层脂质作为脂质提取物用于后续的脂肪酸异丙酯衍生化，其中正己烷与异丙醇的混合体积比为1:2；

9、另一份乳品试样与正己烷/异丙酯混合溶液体积比为1:2，提取上层清液作为脂质提取物用于后续的脂肪酸甲酯衍生化，其中正己烷与异丙醇的混合体积比为3:2。

10、其中，所述步骤（2）具体为，分别向步骤（1）制得的两组脂质提取物中加入衍生化试剂并水浴加热；

11、其中，用于脂肪酸异丙酯衍生化的脂质提取物中加入naoh异丙醇溶液和hcl异丙醇溶液，将脂肪酸衍生化为对应的脂肪酸异丙酯（faipe）；

12、用于脂肪酸甲酯衍生化的脂质提取物中加入naoh甲醇溶液和乙酰氯甲醇溶液，将脂肪酸衍生化为对应的脂肪酸甲酯（fame）。

13、所述脂质提取物加入naoh异丙醇溶液后，50 ℃水浴加热30 min，然后加入hcl异丙醇溶液后，经80 ℃水浴加热150 min；所述脂质提取物加入naoh甲醇溶液后，经50℃水浴加热20 min，然后加入乙酰氯甲醇溶液后，经90 ℃水浴加热150 min；

14、所述naoh异丙醇溶液和naoh甲醇溶液中分别含有2% naoh；所述hcl异丙醇溶液为含有10% hcl的异丙醇溶液；乙酰氯甲醇溶液为含有10%乙酰氯的甲醇溶液。

15、其中，所述步骤（3）具体为，冷却后开盖，沿玻璃试管壁加入超纯水和饱和氯化钠水溶液，使水相和有机相分层界面明显，将两组脂肪酸衍生物——faipe和fame通过正己烷萃取，用于gc-ms分析。

16、其中，所述步骤（4）具体为，取上清液进行gc-ms分析，确定上清液中脂肪酸酯含量，计算乳中fa含量；其中，faipe的测定使用非极性的100%二甲基聚硅氧烷填充的db-1毛细管色谱柱，fame的测定使用强极性氰丙基聚硅氧烷固定相cp-sil 88毛细管色谱柱。

17、其中，所述步骤（5）具体为，采用内标法定量测定faipe含量和fame含量，依据各种faipe和fame的转化系数计算出试样中fa的含量，最终计算得出试样中各c1~c24 fa占总fa的百分比；

18、所测定88种fa的含量值以相对值或绝对值表示；其中，所述相对值的单位是g/100g脂肪酸，所述绝对值的单位为μg/ml乳。

19、采用双内标，其中，内标anteiso c6:0脂肪酸在异丙酯化前加入、c19:0甘油三酯在甲酯化前加入、c17:0脂肪酸乙酯在上机进样前加入。

20、本发明的测定方法可用于乳及乳制品中fa的含量检测、分析乳中fa生理活性功能、乳品生产和加工。

21、同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

22、（1）测定种类多：能测定乳中88种fa含量，包括碳链长度1~24的游离态和结合态的总fa，其中，12种ecsfa、11种ocsfa、13种bcsfa、30种mufa和22种pufa。

23、（2）方法可靠：在fa衍生化、定性分析、定量分析三方面保证fa的可靠测定。

24、在fa衍生化方面，本发明针对不同碳链长度的fa的特点，建立一套scfa（c1~c6）的异丙酯化和mlcfa（c7~c24）的甲酯化的衍生化方法，以异丙酯替代甲酯化减少scfa在样品前处理过程中的挥发损失，以异丙醇作为中间溶剂使水和正己烷两相尽可能互溶，确保易溶于水的游离和易溶于正己烷的结合scfa充分反应并衍生，能实现游离和结合scfa在前处理过程中的充分反应并提取。

25、在定性分析方面，根据faipe和fame的极性特点，选择了以非极性的db-1柱以及强极性的cp-sil 88柱作为分析faipe和fame的最佳色谱柱，在此基础上优化了分流比、载气流速、升温程序、定性定量离子等gc-ms仪器条件，选择色谱分离度高和信噪比高的特征离子作为脂肪酸酯的定量离子，通过质谱的选择特征离子能排除共流出或部分共流出对脂肪酸酯测定的干扰，建立一套scfa（c1~c6）的faipe和mlcfa（c7~c24）的fame的gc-ms测定分析方法，实现目标脂肪酸酯在色谱质谱图上的有效分离，对比保留时间和定性定量离子丰度比双重定性实现fa的高置信度鉴定。

26、在定量方面，针对乳中fa游离和结合形式存在的特点，以乳中不存在且与目标fa性质相近的作为内标选择的标准，建立双内标定量计算方式，以anteiso c6:0 fa（游离态fa）和c19:0 tag（结合态fa）分别作为scfa的faipe和mlcfa的fame的内标校正样品前处理及测定整个过程中存在的误差，并将c17:0 faee（前处理后，上机前加入）作为内标以判断gc-ms仪器状态稳定，排除仪器误差，通过不同类型的fa内标以及在前处理的不同环节引入内标，实现fa的准确定量。经试验方法线性、灵敏度、准确度、精密度满足方法验证的要求，能准确定性定量乳及乳制品中的结合态和游离态fa，方法可靠。

27、（3）简单快捷：本发明采用的fa含量的测定方法更加简单，4-6小时可完成测定。更重要的是，fa作为基本的营养指标，属于乳样的常测指标，以往测定fa均是局部fa，或短链、或中链、或长链，测定数据之间难以统一，本发明的测定方法能够实现乳中c1~c24 fa的测定，解决乳品的fa测定过程中的数据碎片化的问题。

28、（4）适用性强：本发明提出的88种fa的测定方法，通过可以应用于牛乳、骆驼乳和羊乳等不同动物乳的fa测定。

29、下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的乳中88种脂肪酸含量的测定方法及其应用作进一步说明。