一种检测尿液中司坦唑醇代谢物的高灵敏度方法

本发明涉及司坦唑醇代谢物，具体为一种检测尿液中司坦唑醇代谢物的高灵敏度方法。

背景技术：

1、司坦唑醇为蛋白同化制剂，临床上多用于治疗遗传性血管神经性水肿、严重创伤、慢性感染、营养不良等消耗性疾病，具有促进蛋白质合成、抑制蛋白质异生、降低血胆固醇和三酰甘油、促使钙磷沉积等作用。因此经常被非法应用于竞技体育领域，以提高训练成绩，世界反兴奋剂机构将司坦唑醇列为禁止在体育运动中使用的物质之一。司坦唑醇的化学结构较为特殊，含氮杂环的存在提高了药物的生物利用度，但是对检测提出了更高的要求。现有的检测方法多采用液液萃取结合气相色谱质谱联用仪检测尿液样本中的司坦唑醇代谢物，如中国专利申请(公开号为cn 116429958a)公开的测定保健品中5种性激素的方法中，通过对待测物进行前处理，后用液相色谱串联质谱仪测定，可以测定待测物中表睾酮、孕三烯酮、炔诺孕酮、16β-羟基司坦唑醇以及氯司替勃的含量，但灵敏度较低，易受基质干扰。为更好的监测司坦唑醇在竞技体育中的非法使用情况，急需建立一种灵敏度高、特异性好的检测方法。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种检测尿液中司坦唑醇代谢物的高灵敏度方法，能够有效用于监测司坦唑醇在竞技体育中的非法使用情况。

2、本发明提供了一种检测尿液中司坦唑醇代谢物的高灵敏度方法，至少包括以下步骤：

3、(1)将样品进行酶解处理；

4、(2)采用固相萃取柱富集步骤(1)中酶解处理后样品中的司坦唑醇代谢物；

5、(3)将富集后的样品进行衍生化处理；

6、(4)将衍生化处理后的样品取样，采用气相色谱-质谱联用仪检测分析样品。

7、优选的，所述酶解处理具体为：向样品中加入缓冲溶液、d4-19-去甲雄酮溶液、葡萄糖醛酸酶溶液，混合均匀后置于50-60℃的水浴中保温90-150min。

8、优选的，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液的ph为6.0-7.0。

9、作为一种优选的技术方案，所述固相萃取柱富集具体包括以下步骤：

10、s1、取固相萃取柱依次进行活化和平衡；

11、s2、将步骤(1)中酶解处理后样品倒在固相萃取柱上进行上样；

12、s3、上样结束后用淋洗液进行淋洗；

13、s4、待固相萃取柱无液滴自然滴下时，打开真空泵抽干固相萃取柱中的液体，淋洗结束；

14、s5、将洗脱液倒在固相萃取柱上，收集洗脱液，打开真空泵抽干固相萃取柱中的液体，洗脱结束。

15、优选的，所述固相萃取柱采用填充柱床，由非极性c8吸附剂和强阳离子交换(scx)吸附剂组成，具体为bond elute certify spe小柱(6cc，130mg)。

16、优选的，所述活化具体为：将活化剂倒在固相萃取柱上，控制流速为1ml/min，使活化剂一滴一滴流下；所述平衡具体为：将平衡剂倒在固相萃取柱上，控制流速为1ml/min，使平衡剂一滴一滴流下。

17、优选的，所述活化剂为甲醇，所述平衡剂为0.04mol/l的nah2po4水溶液。

18、优选的，上样速度为1ml/min，使步骤(1)中酶解处理后样品一滴一滴流下。

19、优选的，所述淋洗液为5％乙酸水溶液(v/v)和甲醇，分别淋洗，流速均为1ml/min，使淋洗液一滴一滴流下。

20、优选的，所述洗脱液为二氯甲烷、甲醇、氨水的混合溶液，优选的，所述二氯甲烷、甲醇、氨水的体积比为(80-90)：(5-19)：(1-5)，优选为(85-90)：(8-14)：(1-2)，最优选为90：9：1，其中氨水的质量浓度为20-30％。

21、优选的，所述洗脱液的用量为2-4ml，优选为2ml。本发明提供的检测方法，采用上述体积比的二氯甲烷、甲醇、氨水混合溶液作为洗脱液，仅采用2ml的洗脱液，就能够将固相萃取柱上富集的目标物洗脱，有效减少洗脱液用量。

22、优选的，所述步骤s4中控制真空泵的压力低于3inhg，步骤s5中控制真空泵的压力低于5inhg。

23、作为一种优选的技术方案，所述衍生化处理具体为：将步骤(2)获得的洗脱液置于50-60℃氮吹仪上吹干，加入衍生化试剂，在60-75℃的条件下衍生化20-60min。

24、优选的，所述衍生化试剂为n-甲基-n-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(mstfa)或双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(bstfa)与nh4i和乙硫醇的混合，混合配比为1000：2：6(v/w/v)。

25、作为一种优选的技术方案，所述气相色谱-质谱联用仪为三重四极杆型气相色谱质谱联用仪。

26、作为一种优选的技术方案，所述气相色谱-质谱联用仪的参数条件为：采用hp-1色谱柱，初始温度为170-180℃，以2-3℃/min的速率升温至240-250℃，再以15-18℃/min的速率升温至310-330℃并保持2-3min；进样量2μl，进样口温度270-300℃，载气为氦气，恒压分流进样，分流比10：1；碰撞气为氮气，1-2ml/min，淬灭气为氦气，2-2.5ml/min；ei离子源，温度220-240℃，电压70ev，四极杆温度140-160℃，质谱接口温度280-300℃；mrm模式采集数据。

27、优选参数条件为：采用hp-1色谱柱，初始温度为177℃，以3℃/min的速率升温至245℃，再以17℃/min的速率升温至320℃并保持2.5min；进样量2μl，进样口温度280℃，载气为氦气，恒压分流进样，分流比10:1；碰撞气为氮气，1.5ml/min，淬灭气为氦气，2.25ml/min；ei离子源，温度230℃，电压70ev，四极杆温度150℃，质谱接口温度300℃；mrm模式采集数据。

28、本发明建立了尿液样本中低浓度司坦唑醇代谢物的检测方法，通过将尿液中的司坦唑醇代谢物采用葡萄糖醛酸酶溶液进行水解处理，通过固相萃取柱进行富集然后进行衍生化处理后再进行气相色谱-质谱联用方法检测分析，可以满足日常检测需求，具体通过采用bond elute certify spe柱(6cc，130mg)富集尿液样本中的司坦唑醇代谢物，使用二氯甲烷/甲醇/氨水混合液洗脱bond elute certify spe柱上的目标物，与传统液液萃取相比，减少了取样体积，提高了富集效率，改善了色谱峰型。尤其是优化洗脱液中二氯甲烷、甲醇、氨水的体积比为(85-90)：(8-14)：(1-2)，使目标物保持分子状态，易于洗脱的同时保证目标物的洗脱效果。最后，通过对富集后的样品进行衍生化处理，采用高灵敏度的gc-ms/ms质谱仪检测尿液中痕量司坦唑醇代谢物，检出限为0.5ng/ml。

29、有益效果

30、1、本发明提供了一种检测尿液中司坦唑醇代谢物的高灵敏度方法，能够有效用于监测司坦唑醇在竞技体育中的非法使用情况。

31、2、本发明建立了尿液样本中低浓度司坦唑醇代谢物的检测方法，通过将尿液中的司坦唑醇代谢物采用葡萄糖醛酸酶溶液进行水解处理，通过固相萃取柱进行富集然后进行衍生化处理后再进行气相色谱-质谱联用方法检测分析，可以满足日常检测需求。

32、3、本发明具体通过采用bond elute certify spe柱(6cc，130mg)富集尿液样本中的司坦唑醇代谢物，使用二氯甲烷/甲醇/氨水混合液洗脱bond elute certify spe柱上的目标物，与传统液液萃取相比，减少了取样体积，提高了富集效率，改善了色谱峰型。

33、4、本发明通过优化洗脱液中二氯甲烷、甲醇、氨水的体积比为(85-90)：(8-14)：(1-2)，使目标物保持分子状态，易于洗脱的同时保证目标物的洗脱效果。

34、5、通过对富集后的样品进行衍生化处理，采用高灵敏度的gc-ms/ms质谱仪检测尿液中痕量司坦唑醇代谢物，检出限为0.5ng/ml。