一种独蒜兰药材的鉴定方法及指纹图谱检测方法与流程

本发明涉及药材质量检测，尤其涉及一种独蒜兰药材的鉴定方法及指纹图谱检测方法。

背景技术：

1、独蒜兰(pleione bulbocodioides(franch.)rolfe)为山慈菇药材的基原之一，具有清热解毒，化痰散结的功效，临床上常用于多种肿瘤的治疗，也可与其他药味合用，具有增效减毒、治疗尿潴留的功效。但是现行2020年版《中国药典》中山慈菇项下仅包含其显微鉴别，无系统的定性和定量标准，这也导致市场上存在很多山慈菇伪品，给山慈菇及其制剂的临床应用带来了较大的安全隐患。因此，对山慈菇真伪品的鉴别和质量控制变得尤为重要。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明提供一种独蒜兰药材的鉴定方法，通过对特定标记物进行鉴定，完成对独蒜兰药材真伪的鉴定；本发明还提供一种独蒜兰药材的指纹图谱检测方法，该方法专属性强、简单可行，可满足药物分析的要求。

2、为解决上述技术问题，本发明提供一种独蒜兰药材的鉴定方法，以白及苷、dactylorhin a或pleionoid a中至少一种化合物，以及pleionoid b或pleionoid c中至少一种化合物作为鉴定独蒜兰药材的标记物；其中，所述pleionoid a、pleionoid b和pleionoid c的化学结构式分别如式ⅰ、式ⅱ和式ⅲ所示：

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4、发明人在大量实验研究中发现，化合物pleionoid a、pleionoid b和pleionoid c是独蒜兰药材同时含有的特有成分，其和白及苷与dactylorhin a是独蒜兰药材中同时含有的丁二酸联苄酯苷类化合物，而其他山慈菇伪品并无法满足同时含有该5种化合物的条件。因此，发明人以上述5种成分或者部分成分作为标记物，实现了对独蒜兰药材真伪的鉴定。

5、其中，化合物pleionoid a、pleionoid b和pleionoid c为发明人自主命名的化合物，其化学结构分别对应于式ⅰ、式ⅱ和式ⅲ。

6、优选地，以白及苷、dactylorhin a或pleionoid a中任意两种化合物，以及pleionoid b或pleionoid c为标记物。

7、进一步优选地，以白及苷、dactylorhin a和pleionoid a，以及pleionoid b和/或pleionoid c化合物为标记物。

8、本发明的第二方面提供一种独蒜兰药材的鉴定方法，采用超高效液相色谱法，包括以下步骤：

9、取白及苷、dactylorhin a或pleionoid a中至少一种，以及pleionoid b或pleionoid c配制成对照品混合液；取拟鉴定的药材经前处理配制成供试品溶液；

10、分别吸取对照品混合溶液以及供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录对照色谱图和供试品色谱图；比较所述供试品色谱图与所述对照色谱图；

11、其中，具体色谱条件包括：

12、色谱柱：c18柱；

13、流动相：流动相a为水，流动相b为体积比为1：1的甲醇和乙腈的混合液；

14、流速：0.27～0.33ml/min；

15、柱温：25～35℃；

16、进样量：0.5～3μl；

17、检测波长：210～254nm；

18、采用梯度洗脱方式，洗脱程序如下：

19、 时间(min) 流动相a 流动相b 0～10 80％～74％ 20％～26％ 10～20 74％ 26％ 20～30 74％～58％ 26％～42％ 30～45 58％ 42％ 45～55 58％～20％ 42％～80％

20、。

21、发明人以为上述几种标记物作为出发点，摸索获得了独蒜兰药材的鉴定方法。该方法灵敏度高，重复性好，结果可靠，为独蒜兰的质量控制和评价提供了重要依据。

22、该鉴定方法可以同时测定独蒜兰药材中的化合物白及苷、dactylorhin a、pleionoid a、pleionoid b和pleionoid c的含量。

23、优选地，所述c18柱选自waters acquityhss t3、welchxb-c18或thermo scientific hypersilgoldtm vanquish中的任意一种，所述c18柱的规格均为2.1×100mm，1.8μm。

24、优选地，所述流速为0.30ml/min。

25、优选地，所述柱温为30℃。

26、优选地，所述进样量为2μl。

27、优选地，所述检测波长为221nm。

28、结合第二方面，所述供试品溶液经醇类溶液对独蒜兰假鳞茎提取获得，所述醇类溶液包括甲醇、乙醇、甲醇水溶液和乙醇水溶液中的任意一种。

29、示例性地，可采用超声提取的方式对独蒜兰假鳞茎中的丁二酸联苄酯苷类化合物进行提取，提取时可按照1g独蒜兰假鳞茎干燥粉末加入20～150ml提取液的比例进行提取，比如1g：50ml或1g：100ml。

30、优选地，按照1g独蒜兰假鳞茎干燥粉末加入50ml提取液的比例进行提取。

31、在一些实施例中，提取过程的超声时间可以为15～60min，优选为30min。超声提取后还可对提取液用0.22μm微孔滤膜进行过滤。

32、在一些实施例中，提取液所用的醇类溶液可以为无水甲醇、70％甲醇、50％甲醇、10％甲醇、无水乙醇、70％乙醇、50％乙醇或10％乙醇，优选50％乙醇作为提取液。

33、优选地，可采用外标法或一测多评法测定所述丁二酸联苄酯苷类化合物的含量。

34、示例性地，一测多评法通过测定独蒜兰药材中白及苷的含量，进而计算出供试品溶液中dactylorhin a、pleionoid a、pleionoid b和pleionoid c的含量，其对应的相对校正因子依次分别为1.241、0.946、0.919和0.921；所述外标法即用上述超高液相色谱法分别测定空白溶液、对照品溶液和供试品溶液的含量，通过外标法计算供试品溶液中白及苷、dactylorhin a、pleionoid a、pleionoid b和pleionoid c的含量。

35、示例性地，在采用外标法时，白及苷化合物的对照品储备液的浓度范围为0.00485～1.94000mg/ml，dactylorhin a的对照品储备液的浓度范围为0.00505～2.02000mg/ml，pleionoid a的对照品储备液的浓度范围为0.00200～0.20000mg/ml，pleionoid b的对照品储备液的浓度范围为0.00190～0.19000mg/ml，pleionoid c的对照品储备液的浓度范围为0.00260～0.20800mg/ml。

36、结合第二方面，独蒜兰药材的鉴定方法还可采用薄层鉴别法，包括以下步骤：

37、取白及苷、dactylorhin a或pleionoid a中至少一种，以及pleionoid b配制成对照品混合液；取拟鉴定的药材经前处理配制成供试品溶液；

38、分别吸取对照品混合液和供试品溶液在薄层色谱上展开，将供试品薄层色谱图与对照品薄层色谱图进行比较；

39、其中，鉴定所用的展开剂为三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水依次按照体积比3:5:3:1.5:0.25的比例混合得到的混合液。

40、具体地，在以上薄层鉴别方法中，所用检识波长为254nm的紫外光与白光；所用硅胶板为merck hptlc 60f254板、烟台黄海hptlc gf254板、青岛海洋hptlc gf254板或克雷斯特hptlc gf254板，优选为merck hptlc 60f254板；展开距离为70cm；显色剂为0.1％香草醛-10％硫酸乙醇、10％硫酸乙醇或10％磷钼酸乙醇，优选为0.1％香草醛-10％硫酸乙醇。

41、在一些实施例中，喷显色剂后进行适当加热，时间为加热温度为100℃、105℃或110℃，加热5min、10min或15min，优选为105℃加热10min。

42、在一些实施例中，独蒜兰药材的供试品溶液经spe(聚酰胺)前处理后，用20％甲醇洗脱得到的供试品溶液和用甲醇洗脱得到的供试品溶液的点样量可以为5μl、10μl、20μl或25μl。

43、优选地，用20％甲醇洗脱得到的供试品溶液的点样量为10μl，用甲醇洗脱得到的供试品溶液的点样量为20μl。

44、在一些实施例中，标准品dactylorhin a、白及苷、pleionoid a、pleionoid b的点样量可以为5μg、10μg、15μg或20μg。

45、优选地，标准品dactylorhin a、白及苷、pleionoid a和pleionoid b的点样量均为15μg。

46、本发明的第三方面提供一种独蒜兰药材的指纹图谱的检测方法，该检测方法包括构建含有白及苷、dactylorhin a、pleionoid a、pleionoid b以及pleionoid c的指纹图谱。该指纹图谱可用于鉴别独蒜兰真伪品，为独蒜兰的质量控制提供有力保障。

47、结合第三方面，所述检测方法采用超高效液相色谱法，其中，色谱条件包括：

48、色谱柱：c18柱；

49、流动相：流动相a为水，流动相b为体积比为1∶1的甲醇和乙腈的混合液；

50、流速：0.27～0.33ml/min；

51、柱温：25～35℃；

52、进样量：0.5～3μl；

53、检测波长：210～254nm；

54、采用梯度洗脱方式，洗脱程序如下：

55、 时间(min) 流动相a 流动相b 0～10 80％～74％ 20％～26％ 10～20 74％ 26％ 20～30 74％～58％ 26％～42％ 30～45 58％ 42％ 45～55 58％～20％ 42％～80％

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57、本发明提供的独蒜兰药材的指纹图谱的检测方法，可用于检测或分离独蒜兰药材中的成分，所述独蒜兰药材中的成分包括dactylorhin e、dactylorhin a、白及苷、pleionoside m、pleionoid a、pleionoid b和pleionoid c中的一种或多种。

58、结合第三方面，在所述指纹图谱中，以白及苷峰为s峰，在如下一个或多个相对保留时间处有特征峰：0.371、0.565、0.605、1.000、1.216、1.276、1.368、1.561、1.583、1.742和1.816中的至少一个，所述s峰的绝对保留时间为23.18±0.03min，所述相对保留时间的误差在±5％以内。

59、对于绝对保留时间，在所述指纹图谱中，在如下一个或多个绝对保留时间处有特征峰：9.279±0.013min、14.130±0.017min、15.147±0.020min、25.028±0.021min、30.432±0.012min、31.937±0.010min、34.231±0.024min、39.076±0.011min、39.626±0.019min、43.604±0.024min和45.467±0.034min。

60、示例性地，将所述指纹图谱的检测方法用于独蒜兰药材的检测中时，包括以下步骤：

61、取待检测的独蒜兰药材的供试品溶液，采用上述超高效液相色谱法测定得到对应的液相色谱图；

62、将得到的液相色谱图与所述指纹图谱品进行相似度评价。

63、本发明提供的指纹图谱还可用于生产不同形式的产品，比如以计算机存储为介质的电子版产品，或者经绘制或印刷得到的纸质版的说明书，这些产品可作为标准指纹图谱应用于独蒜兰药材的检测与质量控制。

64、本发明的有益效果为：本发明分别提供了独蒜兰药材的鉴定方法和独蒜兰药材的指纹图谱的检测方法，这些方法专属性强、简单易操作，且可满足药物分析的要求，具有结果准确、操作方便的特点；此外，通过对提取方法、色谱条件、前处理方法及薄层展开条件的优化，成功实现了对独蒜兰药材中上述五种成分的含量测定、相似度评价及薄层检识，为该药材质量标准的制定、合理开发利用资源等提供了研究基础。