一种从蚯蚓组织中检测微塑料的方法

本发明涉及检测，具体为一种从蚯蚓组织中检测微塑料的方法。

背景技术：

1、自20世纪50年代以来，塑料的生产迅速增长，据估算，全球塑料年产量高达3.68亿吨，目前仅有9％塑料垃圾被回收利用，其余塑料垃圾则以各种形式进入自然环境中。这些进入自然环境的塑料垃圾经过阳光、机械磨损和生物相互作用而破碎/降解成微塑料(直径小于5毫米)。而土壤作为各类污染物重要的汇集地，其中含有大量的微塑料。土壤中广泛分布的微塑料极易被蚯蚓误食，影响其生存健康。现如今，很多研究者开始对微塑料污染进行研究，旨在寻找对微塑料污染进行整治的办法，但由于微塑料具有粒径小、种类多、吸附性较强等特性，使其难以从生物组织中直接观察定量，增加了微塑料的污染研究难度，目前蚯蚓组织微塑料的检测方法主要面临以下三个问题：

2、(1)蚯蚓长期以土壤中各类物质为食，肠道内含有土壤颗粒、未消化的微塑料等，将这些物质和微塑料分离开的难度较大。

3、(2)微塑料的提取时间较长，目前蚯蚓组织消解时间至少需要24h。

4、(3)微塑料分离难度高：生物体内有各种有机物、无机物，如何准确识别和分离微塑料难度较大，目前较为准确的方法是使用荧光微塑料，但成本过高。

5、因此，亟待寻找一种有效的从蚯蚓组织中提取微塑料的方法，以方便生物样品中微塑料的检测工作，并推进土壤环境中微塑料污染的研究进展。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种从蚯蚓组织中检测微塑料的方法，消解效果好，极大的加快了组织破碎的进程，大大缩短消解的时间。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种从蚯蚓组织中检测微塑料的方法，包括：

4、s1：获得肠道没有排泄物的蚯蚓样品；

5、s2：消解：取1.8～2.2g经步骤s1处理后的蚯蚓样品剪碎，然后浸泡于koh中，在摇床中消解2.5～3.5h，摇床的温度为55～65℃，消解过程中每半小时将消解液取出超声3min，得消解液；

6、s3：过滤：将消解液真空抽滤到聚碳酸酯核径迹蚀刻滤膜上；

7、s4：分离：将步骤s3中滤膜放入离心管中，加入饱和zncl2溶液后超声8～12min；取出滤膜，并用饱和盐溶液冲洗滤膜，冲洗液收集到同一根离心管后，离心8～12min，得上层液；

8、s5：将上层液真空抽滤到一张新的聚碳酸酯核径迹蚀刻滤膜上；

9、s6：干燥：将步骤s5中新的聚碳酸酯核径迹蚀刻滤膜放在烘箱中干燥过夜；

10、s7：荧光染色并计数：向干燥后的聚碳酸酯核径迹蚀刻滤膜上滴加尼罗红溶液使其均匀浸湿，黑暗条件下静置8～12min后，用荧光显微镜观察。

11、进一步地，步骤s1的操作方法为：用超纯水将待测蚯蚓的表面冲洗干净后，放在洁净的润湿滤纸上，以排空肠道，每8h换一次滤纸，该过程持续2天，直到滤纸上不再出现新的排泄物。

12、进一步地，步骤s2中将蚯蚓样品剪碎成0.8～1.2cm的小段。

13、进一步地，步骤s2中koh的浓度为10％、添加量为20ml，摇床的转速为200rpm。

14、进一步地，步骤s4中离心管为50ml，饱和zncl2溶液的加入量为20ml，超声清洗滤膜10min，再用20ml饱和盐溶液冲洗滤膜。

15、进一步地，步骤s6中烘箱的温度为40℃。

16、进一步地，步骤s7中尼罗红溶液的浓度为1ug/ml，滴加量为2～3滴。

17、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

18、(1)本发明通过合理的设计，选择koh作为消解液，并且在消解过程中加入了超声处理，极大的加快了组织破碎的进程，大大缩短消解的时间，且消解效果好，不会产生大量的泡沫，3h其消解率即可达到98.1±1.1％。

19、(2)本发明的分离过程中，没有选择常规的静置分离，而是使用离心机离心，使得微塑料能更快地与其他物质分离，集中到上层液体中；该分离过程与消解过程相结合，使得整个微塑料的提取进程加快了至少一倍以上。

20、(3)本发明在进行分离时，选择饱和zncl2溶液，在保证分离效果的同时，降低了成本。

技术特征：

1.一种从蚯蚓组织中检测微塑料的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的一种从蚯蚓组织中检测微塑料的方法，其特征在于，步骤s1的操作方法为：用超纯水将待测蚯蚓的表面冲洗干净后，放在洁净的润湿滤纸上，以排空肠道，每8h换一次滤纸，该过程持续2天，直到滤纸上不再出现新的排泄物。

3.根据权利要求2所述的一种从蚯蚓组织中检测微塑料的方法，其特征在于，步骤s2中将蚯蚓样品剪碎成0.8～1.2cm的小段。

4.根据权利要求3所述的一种从蚯蚓组织中检测微塑料的方法，其特征在于，步骤s2中koh的浓度为10％、添加量为20ml，摇床的转速为200rpm。

5.根据权利要求4所述的一种从蚯蚓组织中检测微塑料的方法，其特征在于，步骤s4中离心管为50ml，饱和zncl2溶液的加入量为20ml，超声清洗滤膜10min，再用20ml饱和盐溶液冲洗滤膜。

6.根据权利要求5所述的一种从蚯蚓组织中检测微塑料的方法，其特征在于，步骤s6中烘箱的温度为40℃。

7.根据权利要求1～6任一项所述的一种从蚯蚓组织中检测微塑料的方法，其特征在于，步骤s7中尼罗红溶液的浓度为1ug/ml，滴加量为2～3滴。

技术总结
本发明公开一种从蚯蚓组织中检测微塑料的方法，涉及检测技术领域，包括S1：获得肠道没有排泄物的蚯蚓样品；S2：取蚯蚓样品剪碎，浸泡于KOH中，在摇床中消解，每半小时取出，超声消解3min；S3：将消解液真空抽滤到聚碳酸酯核径迹蚀刻滤膜上；S4：将滤膜放入离心管中，加入饱和ZnCl<subgt;2</subgt;溶液后超声；取出滤膜，用饱和盐溶液冲洗滤膜，将冲洗液离心；S5：将上层液真空抽滤到一张新的聚碳酸酯核径迹蚀刻滤膜上；S6：将新的滤膜放在烘箱中干燥过夜；S7：尼罗红试剂荧光染色并计数。本发明选择KOH作为消解液，并且在消解过程中加入了超声处理，极大的加快了组织破碎的进程，大大缩短消解的时间，且消解效果好，不会产生大量的泡沫，3h其消解率即可达到98.1±1.1％。

技术研发人员：游蕊,周娅
受保护的技术使用者：四川省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10