一种白毛银露梅的指纹图谱和含量检测方法及其在中药质量控制中的应用与流程

本发明属于中药领域，具体涉及一种白毛银露梅的指纹图谱和含量检测方法及其在中药质量控制中的应用。

背景技术：

1、白毛银露梅(dasiphora mandshurica(maxim.)juz.)，又名药王茶，华西银腊梅、华西银露梅等，原为蔷薇科委陵菜属植物，近年来被植物学家重新划分为蔷薇科金露梅属植物，其资源丰富，广泛分布于我国陕西、甘肃、青海等各地的干旱山坡、沟谷、岩石坡、灌丛及杂木林中，生长海拔为1200-3400米，陕西境内主要野生于秦岭太白山海拔3000米左右的高山草甸。白毛银露梅以药王茶之名在《太白本草》及《秦岭植物志》记载：“清暑热，益脑清心”，现代临床主要用于治疗糖尿病、高血压、高血脂、失眠、抑郁症等，可长期代茶饮，也可组方治疗糖尿病等代谢性疾病，是一种集治疗、保健、养生作用于一体的药食同源性植物。由于不同地区白毛银露梅中各化学成分含量有明显差异，进而影响其质量效果。目前，国内尚无白毛银露梅质量评价的统一标准，为了弥补白毛银露梅质量评价的空白，防止以次充好等乱象，本发明提出一种白毛银露梅的指纹图谱和含量检测方法及其在中药质量控制中的应用。

技术实现思路

1、本发明提供一种白毛银露梅药材的hplc指纹图谱，其特征在于当hplc色谱条件如下时，所述白毛银露梅药材的hplc指纹图谱基本与图1r或图2b一致；

2、hplc色谱条件如下：

3、色谱柱为agilent poroshell 120sb-c18，规格：150mm×4.6mm，2.7μm；

4、流动相：乙腈为a相，甲醇为b相，0.1wt％磷酸水溶液为c相；

5、梯度洗脱条件：

6、

7、流速：0.5ml·min-1；柱温：25℃；检测波长：254nm；进样量10μl。

8、本发明的另一实施方案提供上述白毛银露梅药材的hplc指纹图谱，其特征在于所述白毛银露梅药材的hplc指纹图谱基本与图1或图2b一致，具有不少于16个特征指纹色谱峰，其中峰7为仙鹤草素，峰9为异槲皮苷，峰10为鞣花酸，峰11为槲皮苷，峰12为萹蓄苷。

9、本发明的另一实施方案提供上述白毛银露梅药材的hplc指纹图谱在白毛银露梅药材质量控制、成分分析中的应用。

10、本发明的另一实施方案提供上述白毛银露梅药材的hplc指纹图谱在白毛银露梅药材质量控制中的应用，其特征在于所述应用包括如下步骤：

11、(1)将白毛银露梅药材粉碎后超声提取，配制成供试品溶液；

12、(2)取步骤(1)得到的供试品溶液，经hplc检测，得供试品的hplc图，其中色谱条件如下：

13、色谱柱为agilent poroshell 120sb-c18，规格：150mm×4.6mm，2.7μm；

14、流动相：乙腈为a相，甲醇为b相，0.1wt％磷酸水溶液为c相；

15、梯度洗脱条件：

16、

17、流速：0.5ml·min-1；柱温：25℃；检测波长：254nm；进样量10μl；

18、(3)将步骤(2)得到的供试品的hplc图与本发明所述的白毛银露梅药材的hplc指纹图谱比较，相似度在0.90以上(优选相似度在0.95、0.98以上)的白毛银露梅药材为合格产品。

19、其中步骤(1)所述的供试品溶液的制备方法如下：将白毛银露梅药材粉碎，过50目筛，称取0.2g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数75％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300w，频率50khz)45分钟，放冷(恢复至室温)，再称定重量，用体积分数75％甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔有机滤膜滤过，即得。

20、本发明的另一实施方案提供一种测定白毛银露梅药材中仙鹤草素、异槲皮苷、鞣花酸、槲皮苷和/或萹蓄苷含量的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

21、(1)将白毛银露梅药材粉碎后超声提取，配制成供试品溶液；

22、(2)取步骤(1)得到的供试品溶液，经hplc检测，根据仙鹤草素、异槲皮苷、鞣花酸、槲皮苷和/或萹蓄苷的峰面积代入相应的线性方程，仙鹤草素：y＝11467.78x+704.70、异槲皮苷：y＝51371.76x-178.05、鞣花酸：y＝123235.14x+59520.84、槲皮苷：y＝47720.46x+80.43、萹蓄苷：y＝62818.88x-635.79，即可得出仙鹤草素、异槲皮苷、鞣花酸、槲皮苷和/或萹蓄苷的含量。

23、其中步骤(1)所述的供试品溶液的制备方法如下：将白毛银露梅药材粉碎，过50目筛，称取0.2g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数75％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300w，频率50khz)45分钟，放冷(恢复至室温)，再称定重量，用体积分数75％甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔有机滤膜滤过，即得。

24、步骤(2)中hplc检测的色谱条件如下：

25、色谱柱为agilent poroshell 120sb-c18，规格：150mm×4.6mm，2.7μm；

26、流动相：乙腈为a相，甲醇为b相，0.1wt％磷酸水溶液为c相；

27、梯度洗脱条件：

28、

29、流速：0.5ml·min-1；柱温：25℃；检测波长：254nm；进样量10μl。

30、与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明通过对不同采集时间的白毛银露梅药材样品hplc分析，首次建立白毛银露梅药材指纹图谱，为白毛银露梅药材的质量控制提供了有效方法；(2)通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)，确定了白毛银露梅药材的hplc指纹图谱共有模式，标定了16个共有峰，除s7样品不合格(相似度0.817)外，其余9批样品(s1～s6、s8～s10)的相似度均大于0.986相似度，均大于0.900(合格产品)，并测定峰7为仙鹤草素，峰9为异槲皮苷，峰10为鞣花酸，峰11为槲皮苷，峰12为萹蓄苷，并建立相应的标准曲线，可以测定其成分含量；(3)由于白毛银露梅中成分众多，各成分溶解性、分离度不同，考察了多个色谱条件，最终选择本发明的色谱条件；分别考察了提取溶剂(30％、50％、75％、100％甲醇)、溶剂量(10ml、25ml、50ml)以及超声提取时间(15、30、45、60min)对待测成分提取率的影响，比较不同提取条件下的色谱峰的峰面积及分离度，最终选择以75％甲醇为溶剂，溶剂量为25ml，超声45min进行提取。流动相分别考察了甲醇-水、甲醇-0.1％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水、甲醇-0.5％磷酸水、甲醇-0.1％甲酸水和乙腈-甲醇-0.1％磷酸水，结果以乙腈-甲醇-0.1％磷酸三相系统进行梯度洗脱分离效果最佳；分别考察了agilent tc-5c18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)kromasil 100-3.5-c18(150mm×4.6mm，3.5μm)、agilent poroshell 120sb-c18色谱柱(150mm×4.6mm，2.7μm)和agilentporoshell 120pfp色谱柱(150×4.6mm，2.7μm)进行考察，在色谱峰数目、峰形和分离度和基线等方面经过综合比较，选择了agilent poroshell 120sb-c18色谱柱，该色谱柱采用了新型的核壳色谱技术，其填料粒径为2.7μm，由1.7μm直径的实心硅胶核和0.5μm厚的多孔外层组成，这种小粒径填料具有与亚2μm填料有类似的高柱效，但柱压能降低40-50％，可以在普通hplc色谱仪上实现相当于uplc的分离效能。此外考察了检测波长分别为230、254、280、300、325nm条件下的分离情况，结果波长在254nm波长下色谱图信息最丰富，且主要色谱峰的峰面积最大，分离度最佳。