本发明属于生物制品分析，具体涉及一种重组人促卵泡激素电荷异质性的检测方法。
背景技术：
1、重组蛋白类药物在生产过程中如细胞培养、纯化以及制剂制备，存储和使用过程等多环节，其电荷属性发生异质性改变，会导致在同一蛋白制品中产生不同的电荷异构体。
2、电荷异质体的存在会影响到产品稳定性、溶解性，导致产品功效和药代动力学改变，产品完全失活，产品免疫原性增强等，电荷异质性的控制程度反应了药物生产工艺的一致性，同时也是重组蛋白类药物的关键质量属性。《药品注册管理办法》第三章“药品上市注册”中第二节“药品上市许可”第35条规定：仿制药应当与参比制剂质量和疗效一致；药品相关规定中也指出要稳步提升药品的安全性有效性可及性，继续推进仿制药质量和疗效一致性评价，完善与仿制药相关的技术指导原则体系、一致性评价政策和技术标准体系，进一步推动仿制药质量提升。因此研究开发重组蛋白类药物电荷异质性分析在其生物类似药的研发及原研药的一致性评价研究，以及工艺质量控制中也是非常价值的。
3、重组人促卵泡激素是一种异源二聚体(α亚基&β亚基)糖蛋白，糖型复杂，目前其电荷异质性常用的检测方法有等电聚焦电泳法(ief法)和毛细管等电聚焦(icief法)，其中，等电聚焦电泳(ief法)可检测样品的等电点，但无法精确分析每个电荷变体；毛细管等电聚焦(icief法)可分析每个电荷变体，但由于缺少馏分收集器，且仪器样品容量只有纳升级，没办法像色谱方法一样放大制备，因此对于分离收集酸碱变异体用于鉴定以及后续表征及活性研究非常困难。当icief分离完成时，还必须使用传统的iex(离子交换色谱法)、ief(等电聚焦电泳)或ffe(自由流电泳)来收集观察到的蛋白质电荷变异体。由于iex、ief或ffe，与icief分离机制和分辨率不同，所收集的馏分通常不能很好地与icief的结果相匹配，长时间的操作和使用了较强烈的化学试剂，还往往导致蛋白在馏分收集过程中发生变性。其中，自由流电泳(ffe)对电荷变异体的收集复杂且繁琐，价格昂贵；iex的分离能力十分有限，很多电荷异构体，尤其是那些微量的电荷异构体无法得到很好的分离，且在电荷异构体的分离和分析过程中往往会涉及高温和极端的ph处理，从而导致额外的电荷异构体的生成，干扰电荷异质性的检测和分析。现有研究中cn108333261a公开了通过ph-iec离子交换色谱法实现待测蛋白电荷变异体的检测，但该方法仅适用检测单抗等简单结构检测，不能用于重组人促卵泡激素等复杂结构电荷异质性检测。cn114113450a公开了使用等度洗脱的离子交换色谱法对蛋白制品中的电荷异质体进行分离，该方法仅能实现简单蛋白的分离检测，也不能实现重组人促卵泡激素等复杂结构电荷异质性检测。
4、鉴于现有分析检测方法在检测重组人促卵泡激素电荷异质性上存在的问题以及药品质量安全的严格要求，开发一种操作简单，既能实现重组人促卵泡激素这类复杂结构电荷变体的有效、精确的分离分析，同时馏分收集简单，满足后续对馏分表征及活性的研究是急需解决的问题。
技术实现思路
1、鉴于现有的重组蛋白电荷异质性分析存在的缺陷，本发明提供了一种hplc的分析方法用于检测重组人促卵泡激素的电荷异质性。该方法能够实现重组人促卵泡激素这类复杂的蛋白的电荷异质体的有效分离，且操作简单，馏分收集方便，成本低，非常便于重组人促卵泡激素电荷异质性的分离鉴定与后续的活性研究分析。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
3、本发明提供了一种重组人促卵泡激素电荷异质性的检测方法，包括如下步骤：采用hplc对重组人促卵泡激素进行组分分离；色谱条件如下：
4、色谱柱：proteomix sax-np5
5、流动相：以tris缓冲液为流动相a，以含nacl的tris缓冲液为流动相b；
6、梯度洗脱程序为：在0min到36～45min期间，流动相a从100％降低到0％～25％，再上升到100％；流动相b从0％升高到75％～100％，再下降到0％。
7、在本发明某些具体实施例中，所述色谱柱为proteomix sax-np5，2.1*250mm*5μm或proteomix sax-np5，4.6*250mm*5μm。
8、在本发明某些具体实施例中，所述色谱柱为proteomix sax-np5，2.1*250mm*5μm时，梯度洗脱程序为：
9、
10、在本发明某些具体实施例中，所述色谱柱为proteomix sax-np5，2.1*250mm*5μm时，梯度洗脱程序为：
11、
12、在本发明某些具体实施例中，所述色谱柱为proteomix sax-np5，4.6*250mm*5μm时，梯度洗脱程序为：
13、
14、在本发明某些具体实施例中，所述色谱柱为proteomix sax-np5，4.6*250mm*5μm时，梯度洗脱程序为：
15、
16、在本发明某些具体实施例中，所述tris缓冲液的浓度为10～30mmol/l，优选20mmol/l。
17、在本发明某些具体实施例中，所述tris缓冲液的ph值为5-6，优选ph值为5.8。
18、在本发明某些具体实施例中，所述流动相b中nacl浓度为300mmol/l-800mmol/l；优选地，流动相b中nacl浓度为300mmol/l、400mmol/l、500mmol/l、600mmol/l、700mmol/l或800mmol/l；优选地，流动相b中nacl浓度为300mmol/l、500mmol/l或800mmol/l；更优选地，流动相b中nacl浓度为500mmol/l。
19、在本发明某些具体实施例中，所述色谱条件还包括：uv检测波长为200nm-300nm，优选地，色谱柱为proteomix sax-np5，2.1*250mm*5μm时波长为215nm，色谱柱为proteomixsax-np5，4.6*250mm*5μm时波长为280nm；；
20、和/或：流速为0.2ml/min～0.6ml/min；优选地，色谱柱为proteomix sax-np5，2.1*250mm*5μm时流速为0.2ml/min，色谱柱为proteomix sax-np5，4.6*250mm*5μm时流速为0.5ml/min；；
21、和/或：进样体积为10μl～50μl，优选地，色谱柱为proteomix sax-np5，2.1*250mm*5μm时进样体积为10μl，色谱柱为proteomix sax-np5，4.6*250mm*5μm时进样体积为50μl；
22、和/或：柱温为20～40℃。
23、本发明有益效果为：
24、本发明提供的一种重组人促卵泡激素电荷异质性的检测方法，通过对液相色谱柱、流动相盐浓度、洗脱程序等影响分离效果的关键因素进行了考察，构建出一种适用于重组人促卵泡激素等这类复杂重组蛋白电荷异质体的分析检测方法。
25、通过使用本发明的方法，至少解决现有的重组人促卵泡激素电荷异质体检测中存在的如下弊端：使用本发明方法检测，能够实现重组人促卵泡激素每个电荷异质体的有效分离，与目前行业金标icief法相比，不仅在电荷变异体酸碱峰分离效果、峰面积百分比基本一致，而且弥补了icief法馏分收集困难的问题。且本发明的提供的检测方法，操作简单，馏分收集相对方便，收集得到的馏分纯度高，方便后续对相关电荷异质体的理化性质和生物活性的分析研究。
26、本发明涉及的检测方法的开发是发明人付出艰辛的劳动获得的，该方法具有普遍适用性，进样体积为10μl、20μl、30μl、40μl、50μl时，各峰数量和分离效果均一致；该检测方法专属性强，空白对照液(仅含有检测样品的辅料溶液)对样品出峰位置完全无干扰；重复性好，平行测试5组实验结果显示，供试品主峰峰面积百分比的rsd为0.1％，高于行业要求(不高于5％)；酸性峰峰面积百分比的rsd为0％，高于行业要求(不高于10％)；碱性峰面积百分比的rsd为2.2％，高于行业要求(不高于10％)。且该方法的精密度高，在不同实验仪器、不同色谱柱检测结果，供试品主峰峰面积百分比的rsd为0.1-0.2％，酸性峰面积百分比的rsd不超过0％-1％，碱性峰峰面积百分比的不超过2.2％-2.6％。分离馏分纯度高，可以直接用于酸碱性峰产品的鉴定、以及活性研究等，为后续重组人促卵泡激素蛋白的生产工艺的优化和质量控制提供非常有价值的参考。
27、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
28、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。