本发明涉及一种傅里叶变换红外光谱快速检测血培养瓶中病原菌的方法。通过采集报阳血瓶培养物的ft-ir指纹图谱，实现血培养瓶中病原菌的快速分型，有利于血流感染病原菌的快速诊断。
背景技术：
1、血流感染(bloodstream infection,bsi)是临床上高发病率和高死亡率的疾病之一，可引起感染性心内膜炎、骨髓炎等严重继发感染，并可能导致严重的败血症。因此早期诊断和快速识别病原体对合理用药，改善患者愈后具有重要意义。
2、血培养后的病原菌鉴定是诊断疑似bsi患者的金标准，是指将患者血液注入血培养瓶，并在自动培养系统中孵育，直到检测到阳性信号的过程。报阳后样本会接种至血平板进行培养和传代纯化，以便后续利用各种技术进行物种鉴定和药敏试验，这使得诊断时间延长至3～7天。
3、目前已经开发了多种方法，缩短了识别bsi病原菌的时间。基质解离飞行时间质谱技术(maldi-tof ms)因其操作简单、高通量以及广谱性的鉴定能力使其在医院常规诊断中得到广泛使用，但由于血培养样品中含有血细胞以及多种非细菌蛋白等，会对maldi-tofms分析造成干扰。因此，如何快速方便的从血培养物中直接识别bsi病原菌一直是研究人员关注的重点。
4、傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy，ft-ir)目前已广泛用于细菌分型。细菌的ft-ir信号是一种极具特异性的指纹图谱，可在种和亚种水平上快速鉴定、分类和大规模筛选细菌。此外，ft-ir更适合于区分不同来源的菌株，对快速澄清菌株之间的关系有价值。ft-ir光谱仪的易用性及其成本效益，加上快速可靠的结果区分到亚种水平，使该方法成为临床诊断的有效工具。
5、最近，bruker daltonik gmbh(德国)推出了ir biotyper，引起了人们对这项技术的更多关注。但目前ft-ir光谱分型技术只限用于经过平板培养后的纯菌分析，培养时间通常为18～24小时(不同菌种所需培养时间不同)。但没有能够应用于复杂体系(如血培养瓶)中病原菌混合物的直接快速分析(直接快速分析是指可直接分析报阳后的血培养物)，也没有能够用于血培养瓶中经红细胞裂解、纯化后的病原菌分型、鉴定等分析。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是：为了解决上述背景技术中的现有技术存在的问题，提供一种拓展基于ft-ir技术的病原菌分型使用范围，大大加快了临床血培养瓶中病原菌的分析速度和准确性的基于傅里叶变换红外光谱快速检测血培养瓶中病原菌的方法。
2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于傅里叶变换红外光谱快速检测血培养瓶中病原菌的方法，包括以下步骤：步骤1：样本制备：选用引起血流感染的常见病原菌，将这些病原菌接种在血平板上，利用ft-ir技术分析的病原菌指纹图谱得到纯菌菌株；取少量纯菌菌株与8～10ml无菌血(即无菌动物血，如猪血或羊血等)混合，得到模拟临床血液感染样本，并将模拟临床血液感染样本注入血培养瓶，将血培养瓶转移至血培养系统中直至报阳后取出，制得血培养物；
3、步骤2：ft-ir分析：取步骤1中制得的血培养物30μl直接涂在caf2靶板上，待干燥后放入ft-ir分型系统中采集指纹图谱信号，收集、扫描并平均，生成最终光谱。
4、一种基于傅里叶变换红外光谱快速检测血培养瓶中病原菌的方法，包括以下步骤：
5、步骤a：样本制备：选用引起血流感染的常见病原菌，将这些病原菌接种在血平板上，利用ft-ir技术分析的病原菌指纹图谱得到纯菌菌株；取少量纯菌菌株与8～10ml无菌血(即无菌动物血，如猪血或羊血等)混合，得到模拟临床血液感染样本，并将模拟临床血液感染样本注入血培养瓶，将血培养瓶转移至血培养系统中直至报阳后取出，制得血培养物；
6、步骤b：加入红细胞裂解试剂：取1ml步骤a中制得的血培养物样本进行离心，弃掉上清，制得沉淀物ⅰ；将10倍浓度的红细胞裂解液用无菌水稀释，得到浓度为1倍的工作液，在制得的沉淀物ⅰ中加入2ml工作液，轻轻吹打混匀，裂解1～2min，转移至离心机8000rpm离心3min，弃去上清，制得沉淀物ⅱ；制得的沉淀物ⅱ用2ml无菌水洗涤2次，制得沉淀物ⅲ；
7、步骤c：ft-ir分析：取步骤b中制得的沉淀物ⅲ涂抹在caf2靶板上，待干燥后放入ft-ir分型系统中采集指纹图谱信号，收集、扫描并平均，生成最终光谱。
8、进一步的，步骤2中ft-ir分析采集的波长范围为4000-900cm-1，分辨率为4cm-1。
9、进一步的，最终光谱采用savitzky-golay导数函数法得到二阶导数谱，在1200-900cm-1波段进行层次聚类。
10、进一步的，层次聚类的参数包括距离度量方法和链接方式，其中，距离度量方法采用欧氏距离，链接方式采用ward算法。
11、进一步的，纯菌菌株的制备过程为：选用引起血流感染的常见病原菌，将这些病原菌接种在血平板上，12～24小时培养后制成菌悬液，取30μl涂抹在在caf2靶板上，待干燥后放入ft-ir分型系统中采集指纹图谱信号。
12、进一步的，菌悬液的浓度大于108cfu/ml。
13、进一步的，常见的病原菌为大肠埃希菌、产气肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、产酸克雷伯菌、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粘质沙雷菌、粪肠球菌、屎肠球菌、阴沟肠杆菌、洋葱博克霍尔德菌、栖地克雷伯菌、人葡萄球菌、肺炎链球菌一种或多种。
14、一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该计算机程序被处理器执行时与建立的相应的数据库做比对，实现所述方法的步骤。
15、一种计算机程序产品，包括计算机程序，该计算机程序被处理器执行时与建立的相应的数据库做比对，实现所述方法的步骤。
16、本发明的有益效果：
17、1、首先，利用ft-ir技术分析了20种常见病原菌指纹图谱，层次聚类分析(hierarchical cluster analysis，hca)分型准确率为100％，为血培养瓶快速分型奠定了基础。接下来，直接采集了20种病原菌在血培养瓶中培养报阳后的血培养混合物的ft-ir指纹图谱，并将该过程重复五次，分型准确率高达94％，并且具有良好的稳定性。与常规检测方法相比，该方法避免了冗长繁琐的纯化步骤，大大缩短了病原菌鉴定的时间。最后，利用红细胞裂解试剂对报阳的血培养物进行简单纯化并采集ft-ir指纹图谱，该方法分型准确率提高至99％，且分析速度仍领先于传统检测方法。综上所述，ft-ir技术对于血培养瓶病原菌的分析具有良好的重复性和准确率；
18、2、拓展了基于ft-ir技术的病原菌分型使用范围，大大加快了临床血培养瓶中病原菌的分析速度和准确性；
19、3、血培养瓶中病原菌报阳后的血培养物，可直接通过ft-ir技术直接分析，无需进行二次培养，分型过程约20分钟左右，相比于现有ft-ir纯菌分型方法，可至少节省18～24小时的培养时间，分型准确率高达94％，大大加快了临床报阳血培养瓶病原菌的分析速度和准确性，并且具有良好的重复性，在临床诊断中具有巨大应用潜力；
20、4、ft-ir技术能够分型经红细胞裂解液裂解纯化后的报阳血培养瓶中的血培养物，其中，红细胞裂解处理约十五分钟左右，然后通过ft-ir技术进行分析测试，共计三十五分钟左右，分型准确率高达99％，重复性良好，且分析速度领先于传统检测方法，具有很强的临床诊断应用潜力。