检测血液样品中激素的方法及试剂盒与流程

本申请涉及检测分析，具体涉及一种检测血液样品中激素的方法及试剂盒。

背景技术：

1、青鳉鱼（属名latipes，种名oryzias）是一种小型淡水鱼类，成年体长约19.3-23.7毫米，广泛分布于东亚地区。青鳉耐受的温度、盐度范围较广，食性杂，饲养管理容易，常成为血液学、遗传学、环境科学、发育生物学以及分子生物学等研究领域的模式生物，是毒性试验的最常用的模式鱼种之一。值得注意的是，青鳉鱼是目前已知的唯一一种具有性别决定基因的鱼类（雌鱼xx染色体，雄鱼xy染色体），由于其在性别系统上与人类等哺乳动物的相似性，因此该鱼类常常作为研究性别发育中激素功能的理想生物模型。青鳉鱼体内的主要激素类型与两栖类、哺乳动物等两性生殖动物具有相似性，即分为雌激素和雄激素。其中雌二醇（e2β）是主要的功能性雌激素，而睾酮（t）和11-酮基睾酮（11-kt）是主要的功能性雄激素，它们都是以摄入的胆固醇为前体物质，在急性调节蛋白（star）、芳香化酶（cyp19）和β-羟基类固醇脱氢酶（3β-hsd和20β-hsd）等多种酶和蛋白的作用下催化生成的。这些激素通过与体内的激素受体相结合，诱导生物体生殖细胞的发生和增殖，促进性腺发育，调节繁殖行为。

2、目前鱼体血液中雌雄激素浓度检测方法主要是酶联免疫吸附试验法（elisa）。其检测原理是用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、hrp标记的检测抗体，经过温育并洗涤。用底物tmb显色，tmb在过氧化物酶的催化下变色，用酶标仪在特定波长下测定吸光度（od 值）。根据标准品的吸光度和标准品的浓度，进行四参数logistic拟合算出标准曲线的回归方程。然后将样品孔的吸光度带入标准曲线，计算出对应的雌雄激素含量。但目前青鳉鱼等小型鱼类使用该方法测量激素浓度时存在几个问题一直没有很好地解决：（1）国内缺少针对青鳉鱼抗体研发的试剂盒，国际上同类产品价格昂贵；（2）使用elisa试剂盒检测血清中激素含量时，对血液量要求较高，目前还无法对一条成年斑马鱼体内的激素浓度水平做到精准定量；（3）实验周期较长，洗涤不干净或显色剂丢失等都会影响吸光度读数，人工操作误差较大。

技术实现思路

1、基于此，本申请一实施方式有必要提供一种检测青鳉鱼血液中雌雄激素浓度的方法及试剂盒，能够通过少量的血液样品快速准确且低成本的检测雌雄激素的含量。

2、技术方案如下：

3、检测血液样品中激素的方法，所述方法包括如下步骤：血液样品前处理，处理后的样品进行超高效液相色谱与质谱联用检测；

4、所述激素为雌激素和雄激素中的至少一种；

5、测定血液样品中雄激素的样品前处理步骤包括：

6、血液样品经离心后获取上清液血浆，向上清液血浆中加入同位素内标物，再加入水及第一有机试剂进行萃取，获取有机相；及

7、吹干所述有机相，用有机溶剂复溶后，进行超高效液相色谱与质谱联用检测；

8、测定血液样品中雌激素的样品前处理步骤包括：

9、血液样品经离心后获取上清液，向上清液中加入同位素内标物，再加入水及第一有机试剂进行萃取，获取有机相；

10、吹干所述有机相，加入nahco3溶液，混匀后加入丹磺酰氯丙酮溶液进行衍生化反应，获得衍生化样品；

11、向所述衍生化样品中加入水及第二有机试剂进行萃取，获取有机相；及

12、吹干所述有机相，用有机溶剂复溶后，进行超高效液相色谱与质谱联用检测；

13、其中，所述第一有机试剂包括甲基叔丁基醚；所述第二有机试剂包括正己烷。

14、在其中一个实施例中，所述雄激素包括睾酮和11-酮基睾酮；所述雌激素包括雌二醇e2β。

15、在其中一个实施例中，所述nahco3缓冲溶液中，nahco3的浓度为80mm~100mm，ph值为10~11；所述丹磺酰氯丙酮溶液中，丹磺酰氯的浓度1.0mg/ml~2.0mg/ml。

16、每2μl~6μl的血液样品前处理的过程中，需要使用300μl~400μl甲基叔丁基醚，3ml~4ml正己烷，100μl~200μl nahco3缓冲溶液，100μl~200μl丹磺酰氯丙酮溶液。

17、在其中一个实施例中，所述有机溶剂包括乙腈或者甲醇。

18、在其中一个实施例中，所述衍生化反应的条件包括60℃~65℃反应8min~10min。

19、在其中一个实施例中，超高效液相色谱的洗脱条件具有如下技术特征中的一个或者多个：

20、（1）以甲醇为流动相 a，以甲酸水溶液为流动相 b；

21、（2）以乙腈为流动相 a，以甲酸水溶液为流动相 b；

22、（3）采用梯度洗脱；

23、（4）色谱柱为acquity uplc beh c8色谱柱；

24、（5）柱温为37℃~40℃；

25、（6）进样体积5μl~10μl；

26、（7）流速为 0.3ml/min~0.5ml/min。

27、在其中一个实施例中，在所述甲酸水溶液，甲酸的体积百分数为0.1%~0.3%。

28、在其中一个实施例中，质谱的条件具有如下技术特征中的一个或者多个：

29、（1）采用正离子模式；

30、（2）毛细管电压为2.5kv~3.2 kv；源温度为100℃~130℃；脱溶剂气温度为420℃~460℃；脱溶剂气流量为800 l/h~900 l/h；锥孔气流量为50l/h~60l/h。

31、检测血液样品中激素的试剂盒，所述试剂盒包括所述的方法中所使用的试剂。

32、相对于传统技术，本申请具备如下有益效果：

33、本申请提供的检测血液样品中激素的方法能够通过少量的血液样品快速准确的检测雌雄激素的含量，利用该方法能够对单条青鳉鱼体内的雌雄激素浓度水平做到精准定量，同时也可适用于其它生物的微量血液激素浓度水平检测，具有良好的技术拓展性和适用性；

34、本申请对雌激素e2的检测的灵敏度更高，且本申请的方法使用的试剂成本低，使非人工成本大大减少。

技术特征：

1.检测血液样品中激素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：血液样品前处理，处理后的样品进行超高效液相色谱与质谱联用检测；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述雄激素包括睾酮和11-酮基睾酮；所述雌激素包括雌二醇e2β。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述nahco3缓冲溶液中，nahco3的浓度为80mm~100mm，ph值为10~11；所述丹磺酰氯丙酮溶液中，丹磺酰氯的浓度1.0mg/ml~2.0mg/ml。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，每2μl~6μl的血液样品前处理的过程中，需要使用300μl~400μl甲基叔丁基醚，3ml~4ml正己烷，100μl~200μl nahco3缓冲溶液，100μl~200μl丹磺酰氯丙酮溶液。

5.根据权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂包括乙腈或者甲醇。

6.根据权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，所述衍生化反应的条件包括60℃~65℃反应8min~10min。

7.根据权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，超高效液相色谱的洗脱条件具有如下技术特征中的一个或者多个：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述甲酸水溶液，甲酸的体积百分数为0.1%~0.3%。

9.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，质谱的条件具有如下技术特征中的一个或者多个：

10.检测血液样品中激素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1~9任一项所述的方法中所使用的试剂。

技术总结
本申请涉及一种检测血液样品中激素的方法及试剂盒。该方法包括如下步骤：血液样品前处理，处理后的样品进行超高效液相色谱与质谱联用检测；其中，测定血液样品中雌激素的样品前处理步骤包括：血液样品经离心后获取上清液，向上清液中加入同位素内标物，再加入水及第一有机试剂进行萃取，获取有机相；吹干所述有机相，加入NaHCO3溶液，混匀后加入丹磺酰氯丙酮溶液进行衍生化反应，获得衍生化样品；向所述衍生化样品中加入水及第二有机试剂进行萃取，获取有机相；及吹干所述有机相，用有机溶剂复溶后，进行超高效液相色谱与质谱联用检测。能够通过少量的血液样品快速准确且低成本的检测雌雄激素的含量。

技术研发人员：王琛,刘月月
受保护的技术使用者：中国环境科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7