红花药材或制剂中成分含量和指纹图谱的检测方法和应用与流程

本发明涉及药物分析方法，尤其是涉及一种红花药材或制剂中成分含量和指纹图谱的检测方法和应用。

背景技术：

1、红花为菊科植物红花 carthamus tinctoriusl.的干燥花，具有活血通经，散瘀止痛的功效。临床主要用于经闭、痛经、恶露不行、癥瘕痞块、胸痹心痛、瘀滞腹痛、胸胁刺痛、跌扑损伤、疮疡肿痛等。目前化学成分研究表明，红花含多种化学成分，包含黄酮、核苷、苯丙素等类型成分。

2、目前，红花药材及其制剂的质量研究多以羟基红花黄色素a、山奈酚等黄酮成作为质控指标进行质量评价可控制。对于化学成分复杂多样的中药材及制剂，以一、两个成分作为质控指标难以反映中药整体质量，多指标成分含量测定的质控方法可以更加全面的进行质量评价。同时，指纹图谱可以从整体上对中药的成分进行分析，可以较全面的表征中药化学成分，体现中药质量的整体性。目前中药多指标成分含量测定以及中药指纹图谱检测方法已作为主要的中药质量评价和控制方法并得到广泛应用。因此，需要开发多指标成分含量测定结合指纹图谱方法来进行红花药材及其制剂的整体质量评价，从而使红花药材及其制剂质控方法更为科学可靠。

3、现有技术中，红花药材及其制剂中不同类型成分同时进行含量测定的方法较少，特别是核苷、黄酮、苯丙醇苷3类成分的一测多评检测方法未见报道。具体分析存在以下问题：红花中主要类型成分黄酮类、核苷类、苯丙醇苷类等成分，这些成分理化性质存在较大差异，由于极性差异较大使得不易实现高效液相色谱的同时分离从而影响其含量测定；同时，由于溶解度不同使得供试品制备及成分提取存在困难。而且，目前红花药材及制剂中多成分检测方法多以外标法进行含量测定，这些方法需要多种对照品来进行含量测定，如公开号为cn116242929a的专利申请公开了一种同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，必须采用9种对照品进行9种成分含量测定，且3种不同类型成分采用3种不同的检测波长进行含量测定，该方法检测条件繁琐，且同时需要9种化学对照品才能进行含量测定。而这中药化成成分对照品往往具有含量不高、稳定性不好、分离难度大、价格昂贵等原因造成了多指标质量控制中对照品匮乏的问题，在品种和数量上均难以满足中药多成分指标质量评价和控制等方面的需求，限制了外标法在中药多成分的定量分析和质量控制中的应用。因此，亟待需要建立红花中多指标成分含量简便、快捷的检测方法以及一测多评含量测定方法，用于红花药材及其制剂的整体质量控制。

4、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供红花药材或制剂中成分含量和指纹图谱的检测方法，可同时测定红花药材或制剂中理化性质差异较大的不同类型的黄酮、核苷、苯丙醇苷类成分中的一种或多种的含量。

2、本发明的另一目的在于提供红花药材或制剂中成分含量和指纹图谱的检测方法在红花药材或制剂的质量控制中的应用。

3、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

4、红花药材或制剂中成分含量和指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：

5、采用高效液相色谱法对红花药材或制剂供试品溶液进行检测；

6、所述检测方法中检测的目标成分包括黄酮类成分和/或核苷类成分和/或苯丙醇苷类成分；

7、所述高效液相色谱法的检测条件包括：

8、以甲醇作为流动相a，乙腈作为流动相b，含酸的水溶液作为流动相c，进行梯度洗脱；

9、所述梯度洗脱的过程包括：

10、0~0.5min内，流动相a的体积分数由0%变至0%~1%，流动相b的体积分数由0%变至0%~1%，流动相c的体积分数由100%变至100%~98%；

11、0.5~2min内，流动相a的体积分数为0%~1%，流动相b的体积分数由0%~1%变至1%~2%，流动c的体积分数为100%~98%变至99%~97%；

12、2~5min内，流动相a的体积分数为0%~1%，流动相b的体积分数由1%~2%变至5%~7%，流动相c的体积分数由99%~97%变至95%~92%；

13、5~8min内，流动相a的体积分数0%~1%，流动相b的体积分数由5%~7%变至8%~10%，流动相c的体积分数由95%~92%变至92%~89%；

14、8~10min内，流动相a的体积分数由0%~1%变至0%~2%，流动相b的体积分数由8%~10%变至11%~12%，流动相c的体积分数由92%~89%变至89%~86%；

15、10~15min内，流动相a的体积分数由0%~2%变至0%~4%，流动相b的体积分数由11%~12%变至12%~13%，流动相c的体积分数由89%~86%变至88%~83%；

16、15~17min内，流动相a的体积分数由0%~4%变至0%~5%，流动相b的体积分数由12%~13%变至14%~15%，流动相c的体积分数由88%~83%变至86%~80%；

17、17~20min内，流动相a的体积分数由0%~5%变至0%~6%，流动相b的体积分数由14%~15%变至15%~18%，流动相c的体积分数由86%~80%变至85%~76%；

18、20~24min内，流动相a的体积分数由0%~6%变至0%，流动相b的体积分数由15%~18%变至17%~19%，流动相c的体积分数为85%~76%变至83%~81%；

19、24~28min内，流动相a的体积分数为0%，流动相b的体积分数由17%~19%变至24%~26%，流动相c的体积分数由83%~81%变至76%~74%；

20、28~30min内，流动相a的体积分数为0%，流动相b的体积分数为24%~26%，流动相c的体积分数为76%~74%；

21、30~40min内，流动相a的体积分数为0%，流动相b的体积分数由24%~26%变至69%~71%，流动相c的体积分数由76%~74%变至31%~29%。

22、在本发明的具体实施方式中，所述梯度洗脱的过程包括：

23、0~0.5min内，流动相a的体积分数由0%变至1%，流动相b的体积分数由0%变至1%，流动相c的体积分数由100%变至98%；

24、0.5~2min内，流动相a的体积分数为1%，流动相b的体积分数为1%，流动c的体积分数为98%；

25、2~5min内，流动相a的体积分数为1%，流动相b的体积分数由1%变至6%，流动相c的体积分数由98%变至93%；

26、5~8min内，流动相a的体积分数为1%，流动相b的体积分数由6%变至9%，流动相c的体积分数由93%变至90%；

27、8~10min内，流动相a的体积分数由1%变至2%，流动相b的体积分数由9%变至11%，流动相c的体积分数由90%变至87%；

28、10~15min内，流动相a的体积分数由2%变至4%，流动相b的体积分数由11%变至13%，流动相c的体积分数由87%变至83%；

29、15~17min内，流动相a的体积分数由4%变至5%，流动相b的体积分数由13%变至14%，流动相c的体积分数由83%变至81%；

30、17~20min内，流动相a的体积分数由5%变至6%，流动相b的体积分数由14%变至15%，流动相c的体积分数由81%变至79%；

31、20~24min内，流动相a的体积分数由6%变至0%，流动相b的体积分数由15%变至18%，流动相c的体积分数由79%变至82%；

32、24~28min内，流动相a的体积分数0%，流动相b的体积分数由18%变至25%，流动相c的体积分数由82%变至75%；

33、28~30min内，流动相a的体积分数为0%，流动相b的体积分数为25%，流动相c的体积分数为75%；

34、30~40min内，流动相a的体积分数为0%，流动相b的体积分数由25%变至70%，流动相c的体积分数由75%变至30%。

35、在本发明的另一具体实施方式中，所述梯度洗脱的过程包括：

36、0~0.5min内，流动相a的体积分数为0%，流动相b的体积分数由0%变至1%，流动相c的体积分数由100%变至99%；

37、0.5~2min内，流动相a的体积分数为0%，流动相b的体积分数由1%变至2%，流动相c的体积分数由99%变至98%；

38、2~5min内，流动相a的体积分数为0%，流动相b的体积分数由2%变至6%，流动相c的体积分数由98%变至94%；

39、5~8min内，流动相a的体积分数为0%，流动相b的体积分数由6%变至9%，流动相c的体积分数由94%变至91%；

40、8~10min内，流动相a的体积分数为0%，流动相b的体积分数由9%变至12%，流动相c的体积分数由91%变至88%；

41、10~15min内，流动相a的体积分数为0%，流动相b的体积分数为12%，流动相c的体积分数为88%；

42、15~17min内，流动相a的体积分数为0%，流动相b的体积分数由12%变至15%，流动相c的体积分数由88%变至85%；

43、17~20min内，流动相a的体积分数为0，流动相b的体积分数由15%变至18%，流动相c的体积分数由85%变至82%；

44、20~24min内，流动相a的体积分数为0，流动相b的体积分数为18%，流动相c的体积分数为82%；

45、24~28min内，流动相a的体积分数为0，流动相b的体积分数由18%变至25%，流动相c的体积分数由82%变至75%；

46、28~30min内，流动相a的体积分数为0，流动相b的体积分数为25%，流动相c的体积分数为75%；

47、30~40min内，流动相a的体积分数为0，流动相b的体积分数由25%变至70%，流动相c的体积分数由75%变至30%。

48、在本发明的具体实施方式中，所述流动相c为含三氟乙酸的水溶液。进一步的，所述流动相c中，所述三氟乙酸的体积分数大于0%且≤0.1%。

49、在本发明的具体实施方式中，所述供试品溶液的制备包括：采用甲醇水溶液对红花药材或制剂进行回流提取，滤过。进一步的，所述甲醇水溶液中，甲醇的体积分数为5%~30%；所述供试品溶液的制备中，所述提取的料液比为0.5g﹕（25~100）ml；所述提取的时间为15~60min。

50、在本发明的具体实施方式中，所述检测条件包括：

51、色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

52、柱温：25~40℃；

53、流速：0.1~0.5ml/min；

54、波长：255~270nm；

55、进样量：1~20μl。

56、在本发明的具体实施方式中，所述色谱柱的规格为100mm×2.1mm，1.8μm。进一步的，所述色谱柱为waters（100mm×2.1mm，1.8μm）。

57、在本发明的具体实施方式中，还包括：采用外标法或一测多评法对所述供试品溶液中的黄酮类成分和/或核苷类成分和/或苯丙醇苷类成分的含量进行测算。

58、在本发明的具体实施方式中，所述黄酮类成分包括羟基红花黄色素a和6-羟基山柰酚-3,6-二-o-葡萄糖苷中的至少一种；所述核苷类成分包括腺嘌呤、胞苷、尿苷、腺苷和鸟苷中的至少一种；所述苯丙醇苷类成分包括紫丁香苷。

59、在本发明的具体实施方式中，采用一测多评法进行测算时，还包括：采用所述高效液相色谱法对含内参物对照品溶液进行检测，根据检测结果计算所述供试品溶液中内参物的含量；根据相对校正因子计算所述供试品溶液中黄酮类成分和/或核苷类成分和/或苯丙醇苷类成分的含量。

60、在本发明的具体实施方式中，以羟基红花黄色素a作为内参物，所述腺嘌呤、胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、紫丁香苷和6-羟基山柰酚-3,6-二-o-葡萄糖苷的相对校正因子分别为0.07~0.17、0.26~0.36、0.23~0.33、0.18~0.28、0.26~0.36、0.22~0.32和0.52~0.62。

61、在本发明的具体实施方式中，所述方法还包括：采用高效液相色谱法对红花药材或制剂供试品溶液进行检测，得到含有20个共有特征峰的指纹图谱；

62、所述20个共有特征峰的相对保留时间分别如下：

63、1号峰：相对保留时间为0.28~0.32；2号峰：相对保留时间为0.32~0.36；3号峰：相对保留时间为0.35~0.39；4号峰：相对保留时间为0.47~0.50；5号峰：相对保留时间为0.48~0.51；6号峰：相对保留时间为0.52~0.55；7号峰：相对保留时间为0.55~0.58；8号峰：相对保留时间为0.69~0.72；9号峰：相对保留时间为0.70~0.73；10号峰：相对保留时间为0.75~0.78；11号峰：相对保留时间为0.78~0.81；12号峰：相对保留时间为0.82~0.85；13号峰：相对保留时间为0.88~0.91；14号峰：相对保留时间为1.00；15号峰：相对保留时间为1.25~1.28；16号峰：相对保留时间为1.27~1.30；17号峰：相对保留时间为1.66~1.72；18号峰：相对保留时间为1.68~1.74；19号峰：相对保留时间为1.94~2.04；20号峰：相对保留时间为2.01~2.11。

64、在本发明的具体实施方式中，所述指纹图谱中，1号峰为腺嘌呤，2号峰为胞苷，3号峰为尿苷，4号峰为腺苷，5号峰为鸟苷，13号峰为紫丁香苷，14号峰为羟基红花黄色素a，16号峰为6-羟基山柰酚-3,6-二-o-葡萄糖苷，17号峰为山柰酚-3-o-芸香糖苷，18号峰为脱水红花黄色素b。

65、本发明还提供了上述任意一种所述检测方法在红花药材或制剂的质量控制中的应用。

66、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

67、（1）本发明的检测方法，可以同时对红花药材或制剂中理化性质和极性差异较大的3种类型8种成分含量进行测定并进行指纹图谱的检测；以黄酮类成分为内参物，建立核苷类成分和/或苯丙醇苷类成分与黄酮类成分的相对校正因子，实现了利用黄酮类成分同时进行黄酮类和核苷类成分的含量测定，并且突破了以往一测多评多以同类化学成分的定量分析的局限；该方法简便、灵敏、高效、准确，解决了对照品紧缺和检测成本高的难题，为红花药材整体质量控制提供更科学、合理的检测方法；

68、（2）本发明的方法可以同时作为红花药材或制剂的指纹图谱检测方法，避免了多次检测操作，缩短了时间，节约检测成本；

69、（3）采用本发明的方法可以更好的实现对红花药材、饮片、配方颗粒以及含有红花的单味或两味制剂等的质量研究及质量评价，根据检测结果保证其质量可控、临床有效性及安全性。