一种用于检测抗MDA5抗体的荧光免疫层析试纸条的制作方法

本发明属于体外诊断生化检测，具体涉及一种用于检测抗mda5抗体的荧光免疫层析试纸条。

背景技术：

1、时间分辨荧光免疫分析技术( time-resolved fluoroimmunoassay，trfia) 是依赖于稀土元素独特的荧光性质而发展起来的一种免疫检测技术，它集合了放射免疫技术、酶联免疫技术以及普通荧光免疫技术的优点，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好，且线性范围宽，荧光寿命长，操作简单和非放射性等特点。基于时间分辨荧光免疫分析技术发展的免疫层析技术较传统的酶联免疫法，除了具有操作简易、反应迅速和时耗较短等特点外，还兼具低成本和高特异性，尤其适用于临场检测。

2、抗黑色素瘤分化相关基因5（mda5）抗体是2005 年日本学者sato提出的一种肌炎特异性抗体，抗 mda5 抗体的自身抗原为一种由 mda5 基因编码的rna解旋酶，在抵抗病毒的固有免疫中起着关键作用。抗mda5抗体阳性的皮肌炎是一种罕见的特发性炎症性肌病亚型，临床上通常表现为对称性近端肌无力、特征性皮肌炎皮疹等。抗 mda5 抗体阳性的患者可能提示有更高的风险患快速进展的间质性肺炎，抗 mda5 抗体滴度与快速进展的间质性肺炎严重度呈正相关，因此对于易患快速进展的间质性肺炎的患者来说，早期的诊断和治疗至关重要。综合来看，抗mda5抗体的检测适用于辅助诊断临床无肌病皮肌炎、预测预后和指导制定治疗方案。

3、目前市面上测试抗mda5抗体的方法主要是elisa，还未见基于荧光免疫层析技术检测抗mda5抗体的荧光免疫层析试纸条。由于抗mda5抗体对mda5阳性的肌炎具有极高的诊断价值，选用合适的检测方法来确定结果的准确性至关重要。因此，检测该指标使用的试剂需要保证极高的敏感性和特异性。然而常规的基于elisa平台开发的抗mda5抗体检测试剂，往往检测成本高，耗时长，且易受自身抗体、嗜异性抗体等干扰而产生假阳，而以荧光免疫层析试纸条的方式进行开发，虽然易满足操作简易、反应迅速和时耗较短等特点，但想要保证足够高的检测敏感性、特异性和准确度，依然存在不小的挑战。

技术实现思路

1、本发明所要解决的问题是提供一种能够提高抗mda5抗体检测敏感度和检测结果准确度的荧光免疫层析试纸条。

2、为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面提供一种用于检测抗mda5抗体的荧光免疫层析试纸条，包括底板和依次搭载在所述底板上的样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述结合垫上包被有荧光微球标记的mda5抗原和荧光微球标记的dnp-bsa，所述硝酸纤维素膜上设有抗体检测线和质控线，其中，所述荧光微球标记的mda5抗原由荧光微球和mda5抗原在rna存在的条件下进行偶联反应，然后经rna酶消解rna所得，所述rna为序列如seq id no：1~6所示的rna中的任意一种或多种。

4、优选地，所述rna为序列如seq id no：1所示的rna。

5、优选地，所述荧光微球为铕螯合荧光微球。

6、优选地，所述荧光微球的粒径为100nm~300nm。

7、进一步优选地，所述荧光微球的粒径为150nm~250nm。

8、更进一步优选地，所述荧光微球的粒径为180nm~220nm。

9、优选地，所述样本垫采用的是玻璃纤维素膜，其上包被有酪蛋白、吐温、海藻糖和异嗜性抗体阻断剂。

10、优选地，所述结合垫采用玻璃纤维素膜，其上包被的荧光微球标记的mda5抗原和荧光微球标记的dnp-bsa的体积比为（10~30）:1，进一步优选为（10~20）:1，更进一步优选为（10~15）:1。

11、优选地，所述检测线由包被在所述硝酸纤维素膜上的鼠抗人igg抗体形成。

12、优选地，所述质控线由包被在所述硝酸纤维素膜上的dnp抗体形成。

13、本发明第二方面还提供上述用于检测抗mda5抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法，所述制备方法包括：

14、采用样本垫封闭液处理第一玻璃纤维素膜制得样本垫；

15、将含有荧光微球标记的mda5抗原和荧光微球标记的dnp-bsa的喷金液喷涂到第二玻璃纤维素膜上，经烘干制得所述结合垫；

16、将鼠抗人igg抗体包被在硝酸纤维素膜上形成检测线，将dnp抗体包被在硝酸纤维素膜上形成质控线；

17、将样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸以及底板组装得到所述用于检测抗mda5抗体的荧光免疫层析试纸条。

18、优选地，所述样本垫封闭液的配方为：0.1~0.5wt%酪蛋白、0.5~1.5wt%吐温、3~8wt%海藻糖、0.05~0.2mg/ml异嗜性抗体阻断剂，其余为ph值为8~9、浓度为40~60mm的tris缓冲液。

19、优选地，采用样本垫封闭液浸润第一玻璃纤维素膜，然后在30℃~60℃下烘干，制得所述样本垫。

20、优选地，在所述喷金液中，在所述喷金液中，所述荧光微球标记的mda5抗原的体积占比为30~50%，所述荧光微球标记的dnp-bsa的体积占比为1~5%。

21、优选地，将所述喷金液喷涂到所述第二玻璃纤维素膜上，在30℃~60℃下烘干，制得所述结合垫。

22、优选地，使用含有2~8wt% 海藻糖的ph值为7.2~7.8的浓度为8~12mm的 pb缓冲液，混合鼠抗人igg抗体得到终浓度为0.5~3mg/ml的检测线包被液；使用含有2~8wt% 海藻糖的ph值为7.2~7.8的浓度为8~12mm的 pb缓冲液，混合dnp抗体得到终浓度为0.5~3mg/ml的质控线包被液；将所述检测线包被液和所述质控线包被液同时在所述硝酸纤维素膜上划线，在30℃~60℃下烘干，形成包被好的硝酸纤维素膜。

23、本发明第三方面还提供一种用于检测抗mda5抗体的试剂盒，其包括上述用于检测抗mda5抗体的荧光免疫层析试纸条和样本稀释液。

24、优选地，所述样本稀释液配方为：40~60mg/ml氯化钠，0.3~0.8wt%防腐剂和0.5~3wt%吐温，其余为ph值为7.2~7.6、浓度为5~15mm的pb缓冲液。

25、进一步优选地，所述防腐剂为proclin 300，所述吐温为吐温-20。

26、本发明第四方面还提供一种基于荧光免疫分析的抗mda5抗体定量检测系统，其包括荧光免疫分析仪、上述荧光免疫层析试纸条和样本稀释液，所述荧光免疫层析试纸条上设有id卡，所述id卡中存储有标定数据和/或标准曲线。

27、优选地，所述样本稀释液配方为：40~60mg/ml氯化钠，0.3~0.8wt%防腐剂和0.5~3wt%吐温，其余为ph值为7.2~7.6、浓度为5~15mm的pb缓冲液。

28、进一步优选地，所述防腐剂为proclin 300，所述吐温为吐温-20。

29、本发明第五方面还提供一种使用上述抗mda5抗体检测系统进行抗mda5抗体检测的方法，其包括以下步骤：

30、（1）将所述荧光免疫层析试纸条插入所述荧光免疫分析仪，读取所述id卡上的标定数据和/或标准曲线；

31、（2）取出所述荧光免疫层析试纸条，将未稀释或稀释后的待测样本滴加到所述荧光免疫层析试纸条上，静置反应5min~15min，未稀释或稀释后的待测样本依次经过所述样本垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜到达所述吸水纸上；

32、（3）将静置反应后的荧光免疫层析试纸条再次插入所述荧光免疫分析仪，读取所述抗体检测线和所述质控线的荧光强度，根据所述标定数据和/或标准曲线计算并输出待测样本的抗mda5抗体浓度。

33、本发明与现有技术相比具有如下优势：

34、本发明通过在荧光微球标记mda5抗原时，引入特定rna共同反应，使得抗原产生构象改变，在偶联荧光微球时保护了抗原的识别表位，偶联后通过rna酶消解rna的操作，提高了结合垫对样本中抗mda5抗体的捕获效率，进而使得制备的荧光免疫试纸条对抗mda5抗体的检测敏感性提高，降低阳性漏检风险。本发明的荧光免疫层析试纸条可以兼顾敏感性、特异性、重复性和稳定性等性能，实现对待测样本中抗mda5抗体的快速检测。