本发明涉及茶叶重金属检测，具体涉及一种用于检测茶叶中cd2+污染物检测系统的制备方法。
背景技术：
1、近年来，由于国际上对绿茶重金属限量标准的提高，我国茶叶出口遭遇绿色壁垒限制，面临巨大经济损失。重金属污染普遍存在于生态系统和人类生活，重金属在环境中只存在化学形态变化，生物无法降解，使之在食物链的生物放大作用下，不断的成倍富集，最终进入人体，随着蓄积量的增多，人体就会出现各种反应，导致健康危机。譬如，茶叶中常见的重金属cd超标会对肾脏、骨骼造成损伤，甚至影响人体的生育能力。
2、目前针对重金属传感分析技术如电感耦合等离子体质谱法、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法等多基于精密仪器的检测，复杂且昂贵，实验洁净度要求高，难以满足现场检测需求。纸基具有便宜常见，生物相容性好，易被修饰，便于印刷等优点，适合作为一次性定性便携传感器的基底载体。作为纸基传感器的一种，试纸条传感器作为当前现场快速检测的有效手段，具有操作简单、价格低廉、反应时间短、便于携带等优点，是最具备商业化检测潜力的传感平台，目前已经在小分子、蛋白、癌细胞和核酸检测等领域得到广泛应用。然而，当前试纸条传感器检测信号难以实现目标物精准、定量检测，且信号收集方式单一，因此其在重金属污染物等多个领域检测中的应用仍处于实验室阶段；考虑到现有电化学传感系统由标准的传感电极、电化学反应池和装置刚性大、结构大的电化学工作站组成，其应用仍处于实验室阶段，无法满足对于绿茶中痕量重金属污染物的便携化、即时检测。
3、因此，提供一种利用颜色变化对目标物进行简单的定性、定量分析，并且可以利用手机收集到的电化学信号对物质精准定量分析的用于检测茶叶中cd2+污染物检测系统的制备方法，已是一个值得研究的问题。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种利用颜色变化对目标物进行简单的定性、定量分析，并且可以利用手机收集到的电化学信号对物质精准定量分析。本发明结合酶生物燃料电池的自供能传感装置构建了一种适用于现场实时重金属检测的新型便携式低成本芯片。通过酶赖氨酸残基上的末端氨基和au nps上的羧基之间进行缩合反应将葡萄糖氧化酶固定在阳极表面作为生物阳极，当cd2+存在时，激活dnazyme的识别cd2+，游离寡核苷酸s1被切割产生rs1打开h1探针，触发hcr反应，h2-god和h3-god通过发夹探针固定在电极表面，催化底物中的葡萄糖氧化产生电子，随着cd2+浓度的增加，电化学信号逐渐增大，向生物阳极滴加显色物质，颜色逐渐加深。在10-6 -1 μg/ml浓度范围内，有良好的线性关系，显示出较高的灵敏度，可于检测茶叶中cd2+污染物检测系统的制备方法。
2、本发明的目的是这样实现的：
3、一种用于检测茶叶中cd2+污染物检测系统的制备方法，包括以下步骤：
4、步骤1：生物偶联物h2-god、h3-god的制备，以备使用；
5、步骤2：寡核苷酸链rs1的制备，以备使用；
6、步骤3：生物阴极的制备，具体的操作如下：将设定量的金纳米颗粒混合溶液滴在离心管中，并在离心管中加设定量 edc/nhs 振荡，激活aunps的羧基，用超纯水冲洗过量的edc/nhs溶液。然后将设定量胆红素氧化酶bod滴加到离心管中并放入4 ℃冰箱上层孵育一夜，通过aunps的羧基和dna末端氨基之间的缩合反应获得bod/aunps，得到第一溶液，将离心管中的第一溶液滴加在芯片表面，在37 ℃下孵育2 h，则得到生物阴极，以备使用；
7、步骤4：生物阳极的制备，具体的操作如下：将设定量的aunps滴在离心管中，并在离心管中滴加设定量的edc/nhs溶液进行振荡，激活aunps的羧基，用超纯水冲洗过量的edc/nhs溶液。随后向离心管中滴加设定量的h1溶液，在4 ℃的条件下反应12 h后，再向离心管中滴加设定量的牛血清蛋白溶液，阻断非特异性结合位点，用蒸馏水冲洗。在37 ℃的恒温箱里反应30 min后，将定量的寡核苷酸链rs1混合溶液滴在离心管中，使寡核苷酸链rs1打开dna链 h1的发夹结构；滴入dna偶联物h2-god和dna偶联物h3-god探针引发hcr反应，使大量信号探针聚集在生物阳极上，即得到第二溶液，将第二溶液滴加在芯片的表面，在37℃下孵育2 h，即可得到生物阳极，以备使用；
8、步骤5：用步骤3中的生物阴极、步骤4的生物阳极和电解液构建用于检测茶叶中cd2+污染物检测系统；
9、步骤6：在所述步骤5中的生物阳极滴加显色物质，形成比色模式，以对茶叶中cd2+污染物进行定性检测。
10、所述步骤3中，所述步骤3中，将50 μl的金纳米颗粒混合溶液滴在离心管中，并在离心管中加50 μl浓度为1 mg ml-1 edc/nhs振荡，然后将30 μl胆红素氧化酶 bod滴加到离心管中并放入4 ℃冰箱上层孵育一夜，得到第一溶液。
11、所述步骤4中，所述步骤4中，将50 μl aunps滴在离心管中，并在离心管中滴加将50 μl浓度为1mg ml-1的edc/nhs溶液进行振荡，随后向离心管中滴加50 μl的h1溶液，在4℃的条件下反应12 h后再向离心管中滴加25 μl牛血清蛋白溶液，在37 ℃的恒温箱里反应30 min后，将10 ul寡核苷酸链rs1混合溶液滴在离心管中，使寡核苷酸链rs1打开dna链h1的发夹结构；滴入dna偶联物h2-god和生物偶联物h3-god探针引发 hcr反应，使大量信号探针聚集在生物阳极上，即得到第二溶液，生物偶联物h2-god和h3-god的浓度均为1.0μm。
12、所述步骤1的具体操作如下：将dna链h2连接到酶氨基酸残基的羧基上，形成一个酰胺键，将h2连接到god上；然后将60 μl的h2和 5 μl的edc/nhs混合，室温搅拌3 h，在超滤离心管中使用 depc纯化并洗涤10次；取400μl葡萄糖氧化酶与1 mg sulfo−smcc混合，振荡10 min，在25 ℃的恒温振荡器中反应3 h, 离心去除多余的sulfo−smcc；最后，将活化后的葡萄糖氧化酶与h2在4 ℃下混合作用48 h，在超滤离心管中用depc纯化10次去除未结合的h2，得到生物偶联物 h2-god。上述方法也用于制备生物偶联物h3-god。
13、所述步骤2的具体操作如下：寡核苷酸链 s1和 s2在95 ℃混合均匀，然后冷却到室温形成dnazyme；随后，将上述混合溶液加入不同浓度梯度目标检测物质cd2+中；在37 ℃的恒温箱中反应3 h；cd2+通过切割 dnazyme的位点形成寡核苷酸链rs1，寡核苷酸链s1和寡核苷酸链s2的浓度均为1.0 μm。
14、本发明的有益效果是：本发明将电化学传感系统集成在试纸条上，第一溶液（生物阴极）和第二溶液（生物阳极）滴涂在试纸条上，通过电化学工作站检测开路电压，可以根据开路电压值快速的对体系中cd2+定量检测。结合读数模块搭建集“供能-传感-监测”于一体的检测系统，可以完成从能源供给，生化传感到信号传输的完整通路，具有体积小、效率高、方便操作的优势，有望实现对于绿茶中重金属污染物的现场监测。且本发明具有输出信号可以联机进行实时查看的优势，检测手段智能化、现代化，符合智慧化发展主题。