本发明属于物质分析检测，具体涉及一种同时检测17种脂肪酸的方法和一种试剂盒。
背景技术：
1、血液中游离脂肪酸，也被称为非酯化脂肪酸，是人体能量代谢的重要组成部分。在正常生理状态下，游离脂肪酸与胰岛素、胰高血糖素等激素的调节密切相关，参与调节能量平衡、脂肪代谢和葡萄糖稳态。当血液中游离脂肪酸水平异常升高时，可能预示着能量代谢失衡，机体无法有效利用和储存脂肪，肥胖、糖尿病、心血管疾病等代谢性疾病的风险增加。因此，监测和管理血液中游离脂肪酸的水平对于维护人体健康具有重要意义。对于新生儿而言，检测其血液中的游离脂肪酸，可以及时发现并处理可能存在的脂肪代谢障碍，如先天性脂肪代谢缺陷或新生儿糖尿病等。通过早期干预，可降低遗传代谢性疾病对新生儿生长发育的不良影响，同时也为后续的随访和治疗提供了重要的参考依据。
2、液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)在检测血液中游离脂肪酸方面已经取得了一些进展。因lc-ms/ms具有高特异性、高通量的特点，其逐渐成为临床检验领域中的有力工具。
3、目前已有一些游离脂肪酸的检测方法被开发和应用，如cn 118837456 a和cn111830163a分别公开了血液中18种游离脂肪酸的方法和试剂盒，但干血斑中游离脂肪酸检测相关的研究较少。与血液样本相比，干血斑采样量少，样本采集过程安全便捷，更易储存且成本更低，特别适用于新生儿和偏远地区疾病筛查，应用潜力巨大。
4、然而，干血斑中脂肪酸的检测存在一些挑战，例如游离脂肪酸直接游离在血液中，但在干血斑中是附着在滤纸载体上，检测前需要将游离脂肪酸从滤纸载体上洗脱并提取出来，如提取率低可能导致低浓度水平的待测物因未达到仪器的检测下限而无法检出。此外，相比于血浆/血清样本，干血斑中还含有血细胞、滤纸纤维等复杂成分，其中的杂质可能会和游离脂肪酸的色谱峰重叠或者影响其离子化效率，需要在样本处理和检测过程中对其中的杂质进行分离，避免其对检测结果的干扰。
5、cn 110146627 a报道了干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒，样本处理的过程涉及干血斑提取、两次衍生、两次氮吹、复溶，操作复杂且耗时长，无法满足临床大批量样本的快速检测需求，且该方法可检测的游离脂肪酸数量较少，无法全面评估脂肪酸代谢情况。
6、因此，需要开发一种操作简便且能同时定量检测干血斑中多种游离脂肪酸的方法和试剂盒。
技术实现思路
1、本发明的目的就是为了解决上述问题至少其一而提供一种同时检测17种脂肪酸的方法和一种试剂盒，以解决现有技术中干血斑中脂肪酸的检测为去除杂质需复杂的处理过程，且可测定的游离脂肪酸数量少的问题。本方案提出的检测方法通过优选的模拟基质与萃取液类型配合优化的液质条件，实现了干血斑中多达17种脂肪酸的精确、快速且便利的检测，且对测试设备的要求低。
2、本发明的目的通过以下技术方案实现：
3、本发明第一方面公开了一种同时检测17种脂肪酸的方法，包括如下步骤：
4、s1：取标曲干血斑进行萃取并离心，得到标曲上清液；
5、s2：在液相色谱仪中通过梯度洗脱分离标曲上清液的干扰组分，得到标曲测试样本；
6、s3：在质谱仪中通过内标法检测标曲测试样本；
7、s4：取不同脂肪酸浓度的标曲干血斑重复步骤s1～s3，以标曲干血斑中脂肪酸浓度为x轴，脂肪酸与对应内标物的峰面积比为y轴，建立各脂肪酸的校准曲线；
8、s5：取待测干血斑进行萃取并离心，得到待测上清液，在液相色谱仪中通过梯度洗脱分离得到待测物，通过内标法在质谱仪中检测待测物，根据校准曲线计算待测干血斑中各脂肪酸的浓度；
9、所述的脂肪酸包括月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、棕榈酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、顺-11-二十碳烯酸、二十碳三烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸-ω3、二十二碳五烯酸-ω6和二十二碳六烯酸；
10、所述的萃取的过程中使用内标萃取液进行干血斑的萃取，所述的内标萃取液为含有内标物的萃取液。
11、优选的，所述的标曲干血斑为加入有模拟基质的标准品溶液的干血斑；所述的标准品溶液为17种脂肪酸的混合溶液。
12、优选的，所述的模拟基质为5～20mg/ml的牛血红蛋白溶液、50～150mg/ml的无脂肪酸牛血清白蛋白溶液和ph为7.3～7.5的缓冲液组成的混合体系。
13、优选的，所述的萃取液为含10vol％异丙醇的甲醇溶液。
14、优选的，所述的内标物包括月桂酸-d3、肉豆蔻酸-d3、棕榈酸-d4、棕榈油酸-d13、油酸-d17、亚油酸-d5、α-亚麻酸-d14、二十碳三烯酸-d6、花生四烯酸-d8、二十二碳五烯酸-ω3-d5和二十二碳六烯酸-d5。
15、优选的，所述的干血斑与内标萃取液的体积比为1：(10～20)，其中，干血斑的直径为6mm。
16、优选的，所述的液相色谱仪的色谱条件为：
17、流动相a：含20mm乙酸铵的水溶液；
18、流动相b：乙腈；
19、色谱柱：agilent infinitylab poroshell 120ec-c18，3.0×50mm，2.7μm；
20、流速为1ml/min，柱温为40℃，进样体积为2μl。
21、优选的，所述的梯度洗脱为：
22、在0～6.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比保持在55:45；
23、在6.5～8分钟内，流动相a和流动相b的体积比由55:45匀速渐变至52.5:47.5；
24、在8～8.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比由52.5:47.5匀速渐变至50:50；
25、在8.5～9.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比由50:50匀速渐变至45:55；
26、在9.5～12分钟内，流动相a和流动相b的体积比保持在35:65；
27、在12～13.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比保持在20:80；
28、在13.5～14.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比由20:80匀速渐变至15:85；
29、在14.5～15.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比保持在55:45。
30、上述范围均为：包含右端值、不包含左端值。
31、优选的，所述的质谱仪的条件为：在电喷雾电离模式下，采用多反应监测进行负离子模式扫描；电喷雾电压为-4500v，离子源温度为600℃，碰撞气为8unit，气帘气与离子源气体1和气体2均为20psi。
32、优选的，步骤s5中，取质控干血斑进行萃取并离心，得到质控上清液，在液相色谱仪中通过梯度洗脱分离得到质控测试样本，通过内标法在质谱仪中检测待测物，根据校准曲线计算质控干血斑中各脂肪酸的浓度。
33、其中，质控干血斑为加入有模拟基质的标准品溶液的干血斑，质控干血斑与内标萃取液的体积比为1：(10～20)，其中，干血斑的直径为6mm；并且，质控干血斑设置至少两个，其具体的脂肪酸浓度已知且介于校准曲线可精确测定的上下限之间。进而，通过质控干血斑的引入，可以将质控干血斑的检测结果与靶值(靶值为质控干血斑的浓度值，该浓度值根据制备过程的投料计算得到，为已知值)进行比较，当质控干血斑的检测浓度在允许的靶值范围内，说明该测试结果的准确度满足要求。
34、本发明第二方面公开了一种试剂盒，包括具有不同脂肪酸浓度的标曲干血斑和内标萃取液；
35、所述的试剂盒按照如上任一所述的方法进行17种脂肪酸的同时检测。
36、优选的，所述的试剂盒还包括质控干血斑。
37、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
38、(1)本发明选择牛血红蛋白、无脂肪酸牛血清蛋白和缓冲液的混合体系模拟全血基质(模拟基质)，用于标曲干血斑和质控干血斑的制备，该体系能较好地模拟全血干血斑(待测干血斑)的基质组分，降低基质效应对检测结果的影响；
39、(2)本发明采用体积比为1：9的异丙醇和甲醇作为萃取液，实现一步提取法从干血斑中选择性提取待测物，无需氮吹、衍生等复杂操作，大幅简化了对干血斑中脂肪酸含量的检测过程；
40、(3)本发明通过对液质条件的优化，实现17种不同浓度级别的游离脂肪酸联检，消除复杂基质及同分异构体对目标检测的干扰；
41、(4)本发明的方法适用于普通的液相色谱串联质谱仪，无需选用超高效液相色谱串联质谱仪，对仪器设备的要求更低，应用范围更广；
42、(5)本发明检测的对象为干血斑，单次检测中使用直径为6mm的血斑，相当于10μl全血，所需的干血斑用样量少，即取血量少，适合更多人群的检测；
43、(6)试剂盒在2-8℃条件下可稳定2年，能够批量制造并运输、存储，具有较低的成本并可顾及偏远地区使用。