一种基于替代分析物法的LC-MS/MS同步定量检测尿毒素对甲酚硫酸盐及吲哚酚硫酸盐的方法及应用

本发明属于生物标志物检测，具体涉及一种基于替代分析物法的lc-ms/ms同步定量检测尿毒素对甲酚硫酸盐及吲哚酚硫酸盐的方法及应用。

背景技术：

1、尿毒症毒素（uts）是晚期肾衰竭患者体内蓄积的物质，可与机体的生物功能产生不良相互作用。蛋白结合尿毒症毒素（pbut）分子在血液循环中以游离溶质形式和与蛋白结合形式存在。在尿毒症患者血液透析过程中，蛋白结合态尿毒素几乎无法被清除。pbuts 在体内的蓄积在临床是与肾脏、心血管和骨骼毒性高度相关。

2、吲哚酚硫酸盐（inds）和对甲酚硫酸盐（pcs）是肾功能和心血管事件的敏感生物标志物，准确检测血液中不同形态的inds和pcs浓度对临床诊疗具有重要意义，应持续受到监测，以保护患者免受疾病进展及其不良后果的影响。近几十年来，已有采用lc-uv、lc-fl（紫外、荧光）、lc-ms/ms以及 lc-qtof- ms（四极杆飞行时间质谱）对inds和pcs进行定量的报道。然而，由于缺乏制备校准和质控（qs）样品的空白物基质，不能对生物基质中inds和pcs进行准确定量分析。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于替代分析物法的lc-ms/ms同步定量检测尿毒素对甲酚硫酸盐及吲哚酚硫酸盐的方法及应用。本发明使用稳定同位素作为替代分析物和内标，用真实基质来定量血清中总inds和pcs，既克服了内源性物质分析没有空白基质的困难，又消除了生物样本分析的基质效应，从而使pcs和inds的定量分析准确、可靠，为临床实践提供有价值的数据支撑。

2、为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明的第一个方面，提供一种基于替代分析物法的lc-ms/ms同步定量检测尿毒素对甲酚硫酸盐及吲哚酚硫酸盐的方法，包括以下步骤：

4、（1）建立替代分析物pcs-d4和inds-d4生物基质标准曲线；

5、（2）将待测样本与甲醇溶液混合，之后与含内标的乙腈溶液混合，离心，取上清液与蒸馏水混合，得到样本溶液；

6、（3）取样本溶液进行lc-ms/ms检测，根据检测结果结合标准曲线计算待测样本中对甲酚硫酸盐及吲哚酚硫酸盐的浓度；

7、所述内标为pcs-d7和inds-13c6。

8、作为内源性待测物，无论是从分析和验证的角度来看，inds和pcs的定量测定都更为复杂，由于缺乏待分析物含量足够低的真正空白基质，标准加入法通常难以制备校准或qc样品因为很难获得不含待分析物的空白生物基质样本或具有准确已知分析物浓度的样本；使用替代基质和真实分析物定量法往往容易导致基质效应，基质效应可能是离子抑制，也可能是离子增强，inds和pcs的准确浓度直接受到基质效应的影响，尤其是当基质效应使分析物和内标（is）产生质谱行为差异时。因此，对生物基质中inds和 pcs进行准确定量分析是技术人员面临的一大难题。

9、上述方法中，本发明创造性的采用稳定同位素标记的对甲酚硫酸盐-d4和吲哚酚硫酸盐-d4作为替代分析物，结合简单的样品前处理、优化的色谱、质谱条件，建立双重定量检测体系。突破性地解决了肾病生物标志物在没有空白基质情况下生物样本中的定量难题，并使游离态目标物的检测灵敏度达0.01 μm，加标回收率77.3%-104.3%，批内、批间精密度rsd＜15%，可精准量化ckd患者血清中两种形态毒素的浓度，为评估尿毒素的病理毒性风险提供关键数据支持。

10、在本发明的一些具体实施方式中，步骤（1）中，所述建立替代分析物pcs-d4和inds-d4生物基质标准曲线包括：

11、a、系列浓度标准曲线工作液的制备：取pcs-d4、inds-d4标准物质，加30%甲醇水溶液溶解并稀释成系列浓度；分别取系列浓度的溶液加入生物基质，内标溶液，混匀、沉淀，取上清，与蒸馏水按体积比1：2混合即得；

12、b、吸取系列浓度标准曲线工作液注入lc-ms/ms仪，测定替代分析物pcs-d4、inds-d4与内标pcs-d7、inds-13c6峰面积比，得到pcs-d4、inds-d4的标准曲线。

13、其中，内标溶液的制备包括：取pcs-d7和inds-13c6标准物质，用乙腈稀释，即得内标溶液。

14、本发明的一些实施方式中，所述生物基质包括血清和血清滤液。

15、其中，血清用于定量分析总的pcs、inds在血清中的含量，包括游离态尿毒素和蛋白结合态尿毒素；血清过滤溶液用于定量分析血清中游离态pcs、inds。

16、进一步地，所述血清滤液制备方法为：将一份血清样本加入millipore amiconultra-4 centrifugal filter 10 kda mwco超滤离心管，7500×g离心后，即得血清的滤液样本。

17、在本发明的一些实施方式中，步骤a所述系列浓度的溶液、生物基质、含内标乙腈溶液体积比为5：50：100；离心获得的上清与蒸馏水的体积比为1:2；所述系列浓度的溶液中pcs-d4、inds-d4血清中浓度为0.025~50 μm，血清滤液中的浓度为0.025~50 μm。

18、在本发明的一些实施方式中，步骤（2）中，所述待测样本、甲醇溶液与含内标的乙腈溶液的体积比为（5~15）：1：（10~30），所述甲醇溶液为30%甲醇水溶液。

19、在本发明的一些实施方式中，步骤（2）中，所述含内标的乙腈溶液中内标的浓度为0.5~1.5 μm。

20、在本发明的一些实施方式中，步骤（2）中，所述待测样本与甲醇溶液混合在涡旋下进行，所述涡旋的时间为20~40s，涡旋后在室温放置1~3min。

21、在本发明的一些实施方式中，步骤（2）中，所述与含内标的乙腈溶液混合在涡旋下进行，所述涡旋的时间为1~3mim。

22、其中，待测样本、甲醇溶液与含内标的乙腈溶液的体积比可以是10：1：10，10：1：11，10：1：12，10：1：13，10：1：14，10：1：15，10：1：16，10：1：17，10：1：18，10：1：19，10：1：20或10：1：30等，含内标的乙腈溶液中内标的浓度可以是0.5 μm、0.6 μm、0.7 μm、0.8 μm、0.9 μm、1.0 μm、1.1 μm、1.2 μm、1.3 μm、1.4 μm或1.5 μm等，步骤（2）所述待测样本与甲醇溶液混合涡旋时间可以是20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s或40s等，涡旋后在室温放置时间可以为1min、2min或3min等，所述与含内标的乙腈溶液混合涡旋时间可以为1min、2min或3min等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

23、进一步地，步骤（3）测定浓度过程中，每批样本都包括一定量的质控样本，具体步骤为：按照步骤a的方法，配制替代分析物浓度为低、中、高的质控血清、血清滤液样本，取上清注入lc-ms/ms仪，监测每批样本测定过程准确度。质控样本的数量约为每批样本数量的6%，低、中、高样本均匀分布于每批样本中。

24、在本发明的一些实施方式中，步骤（3）中，所述lc-ms/ms的液相条件包括：进样量为1~10 μl；色谱柱为thermo hypersil goldtm c18色谱柱，2.1×150mm，5 μm；柱温为35~45℃；流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a为甲酸-乙酸铵水溶液，所述流动相b为甲醇-异丙醇溶液；流速为0.40~0.55 ml/min。

25、在本发明的一些实施方式中，所述流动相a为含有0.1%甲酸的5 mm乙酸铵溶液，所述流动相b为90%甲醇-10%异丙醇。

26、其中，进样量可以是1 μl、2 μl、3 μl、4 μl、5 μl、6 μl、7 μl、8 μl、9 μl或10 μl等，柱温可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃等，流速可以是0.40 ml/min、0.41 ml/min、0.42 ml/min、0.43 ml/min、0.44 ml/min、0.45 ml/min、0.46 ml/min、0.47 ml/min、0.48 ml/min、0.49 ml/min、0.50 ml/min、0.51 ml/min、0.52ml/min、0.53 ml/min、0.54 ml/min或0.55 ml/min等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

27、在本发明的一些实施方式中，步骤（3）所述lc-ms/ms中，液相的洗脱方式为梯度洗脱。

28、在本发明的一些实施方式中，所述lc-ms/ms的质谱条件包括：

29、离子源：电喷雾离子化源；质谱检测模式：多离子反应监测负离子模式；扫描时间：9 min，离子源电压：-3.0kv，离子源温度：550°c，气帘气、雾化气、辅助器分别为：25 psi、65psi、75 psi；解簇电压为：-45 v。

30、在本发明的一些实施方式中，所述待测样本为血清或血清滤液。

31、本发明的第二个方面，提供所述基于替代分析物法的lc-ms/ms同步定量检测尿毒素对甲酚硫酸盐及吲哚酚硫酸盐的方法在用于检测肾脏、心血管和骨骼毒性相关疾病中对甲酚硫酸盐及吲哚酚硫酸盐含量的应用。

32、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

33、（1）针对现有技术中内源性尿毒素检测存在的基质干扰严重、空白基质不可获得，进而无法获得分析物在生物基质中的绝对含量的缺陷，本发明创新性地采用稳定同位素标记的对甲酚硫酸盐-d4和吲哚酚硫酸盐-d4作为替代分析物，结合简单的样品前处理、优化的色谱、质谱条件，建立了双重定量检测体系。

34、（2）本发明突破性地解决了肾病生物标志物在没有空白基质情况下生物样本中的定量难题，并使游离态目标物的检测灵敏度达0.01 μm，加标回收率77.3%~104.3%，批内、批间精密度rsd＜15%，可精准量化ckd患者血清中两种形态毒素的浓度，为评估尿毒素的病理毒性风险提供关键数据支持。