一种提高单个dna分子afm图像对比度的方法

专利名称:一种提高单个dna分子afm图像对比度的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高单个DNA分子AFM图像对比度的方法。
背景技术：
原子力显微镜(AFM)是研究生物大分子最有用的成像工具之一。利用它不但可获得空气氛围中的生物分子(如DNA和蛋白质)形貌图像，而且可获取近生理的液体环境下的生物分子形貌信息，这为研究生物分子的结构和相互作用提供了有效的手段。空气中对生物分子的成像多采用轻敲模式，由于受针尖压力、表面作用力等的影响，测得柔软生物分子高度值往往要比实际小，减小针尖对测量物体的压力可提高高度测量的数值，这样能够较好地反映出生物分子的真实信息。
目前为止，对如何提高DNA分子AFM图像对比度的方法报道很少，但是已经有针对如何提高纳米材料(如多聚物)成像对比度的方法，主要采用两种方法。其一，采取化学修饰的方法，对针尖进行修饰，通过改变针尖与扫描对象作用力的方法，提高图像的对比度。其二，采用修饰纳米材料本身的方法，使其尺度增加，达到提高成像对比度的目的。

发明内容
本发明的目的在于提出一种新的提高单个DNA分子AFM图像对比度的方法，增加AFM图像上单个DNA分子的高度，从而提高DNA分子图像的对比度。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下:
一种提高单个DNA分子AFM图像对比度的方法，包括如下步骤:
(I)修饰云母衬底和制备DNA分子样品，使所述DNA分子固定在所述云母衬底表面上；
(2)将所述DNA分子样品安装在AFM仪器上；
(3)用水溶液修饰AFM针尖1-10分钟；
(4)修饰后的AFM针尖取出后安装在扫描头上，对所述衬底上的DNA分子进行扫描成像。
步骤⑴中，用I(T8-K)-1qM纳米金(Nanogold)溶液或KT2-KTM Ni离子溶液修饰云母衬底IOul约I分钟后。采用分子梳的方法将所述DNA分子拉直并固定在所述云母衬底表面上。
步骤⑶中，所述水溶液中含0.1-1%甘油。
或，所述水溶液是TE缓冲液(Tris-HCl)，其浓度是10_2M，pH值是8.3。所述TE缓冲液中可含有浓度2X 10_3M的MgCl2或CaCl2。
应用本发明的方法，扫描时修饰在AFM针尖上的溶液会转移到衬底上的DNA分子上，DNA分子高度明显增加，但云母衬底变化较小，这一过程就是蘸笔纳米刻蚀(DPN)的过程。这样，DNA分子与云母衬底的反差增大，所以，图像的对比度有显著的提高。本发明的提高单个DNA分子AFM成像对比度的方法简单方便，且在不同方法修饰的云母衬底表面上有效。


图1a是本发明的第一个实施例的DPN前DNA的形貌图像；
图1b是图1a的横截面图像；
图1c是本发明的第一个实施例的DPN后DNA的形貌图像；
图1d为图c的横截面图像；
图2a是本发明的第二个实施例的DPN前DNA的形貌图像；
图2b是本发明的第二个实施例的DPN后DNA的形貌图像。
具体实施方式
下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述，使能更好地理解本发明的功能、特点。
本发明的 提高单个DNA分子AFM图像对比度的方法，具体包括如下步骤:
(I)修饰云母衬底和制备DNA样品。本发明中，衬底为云母衬底，DNA分子为线状DNA如lambda DNA或环状DNA如pBR322。用于修饰所述衬底的试剂可以是纳米金球(或称为纳米金颗粒、金颗粒；来自英文的Au particle或Nanogold)溶液或镍离子溶液。将DNA样品溶液滴在修饰的云母衬底上，利用分子梳技术将DNA分子拉直并固定。修饰云母衬底的作用是使云母表面带正电荷，这样带负电荷DNA分子就可固定在带负电荷的云母表面上了，以用于AFM成像。通常的云母衬底，镍离子和纳米金球修饰的云母表面均可用于本发明的方法。
(2)将所述DNA样品安装在AFM成像仪器上。本发明中采用的AFM成像仪器是MultiMode Scanning Probe Microscope 系统。其扫描头为 J 型。AFM 的探针为 NSC 11 和NSC35 (非接触硅针尖)。成像温度控制在25°C左右，湿度在30-60%左右。同样，其他类型或型号的AFM成像仪器以及其他型号的AFM探针也可用于本发明的方法。
(3)将AFM针尖放置在含水溶液中修饰1_10分钟。通过非特异性吸附，所述溶液部分吸附于AFM针尖上。这里，水溶液可以是含有0.1-1 %甘油的水溶液，甘油可减少水分的蒸发，以增强针尖的修饰效果。水溶液也可以是其他的缓冲液，如TE缓冲液(10_2MTris-HCl, ρΗ8.3)，并可在TE缓冲液中加入一定浓度的其他物质，如2X IO^3M MgCl2'2X IO^3M CaCl2，以增强水溶液转移到DNA分子上的作用。不同材料针尖放置浸泡时间应有所不同。
(4)修饰后的AFM针尖取出后安装在扫描头上，对DNA分子进行扫描成像。
下面给出两个实施例，具体说明本发明的方法是如何实现提高单个DNA分子的AFM成像对比度。
实施例1:在纳米金颗粒修饰的云母衬底上增加的DNA对比度成像效果
将新解理的云母衬底用1(Γ8Μ的纳米金(Nanogold)溶液IOul修饰约I分钟后，用蒸馏水将游离的纳米金冲洗掉。
将DNA溶液滴在纳米金修饰的云母衬底上，利用分子梳方法将DNA分子拉直并固定。具体做法是，用TE缓冲液将λ DNA稀释到浓度l-20ng/ul范围内，取出2_5ul上述稀释的DNA溶液放置在修饰的云母衬底一端，用干净的盖玻片轻轻与液滴接触，慢慢地将整个盖玻片沿着云母衬底的表面移动。在此过程中，由于水流弯月面的作用DNA被拉直，由于云母衬底对DNA的吸附作用，DNA分子被固定在云母衬底上。
DNA样品在空气中或氮气中干燥后，用AFM针尖进行扫描成像，如图1a和图1b所示，此图像为蘸笔纳米刻蚀技术(DPN)前的图像。
接下来，将AFM针尖(NSC 11)用前面提到的含0.1_1%甘油的水溶液修饰1_10分钟后，优选的为I分钟，安装在AFM上；采用AFM对云母衬底上原来位置的DNA分子进行扫描成像，此过程为DPN成像，如图1c和图1d所示。
为了比较对比度变化的效果，我们对DPN前和DPN后的DNA分子原位图像进行比较。
图1a为DPN前DNA分子的形貌图像，图1b为图1a的横截面图像。图1c为DPN后DNA分子形貌图像，图1d为图c的横截面图像。扫描范围为ΙΟμπιΧΙΟμπι。从图1b和图1d对DNA分子的高度和宽度进行统计，结果如下:图1b中DNA分子的高度为0.2±0.1nm ；DNA分子的宽度为25.1 ±4.7nm。图1d中DNA分子的高度为1.9±0.4nm ;宽度为28.7±5.8nm。其高度增加了 1.7nm,宽度增加了 3.6nm.在利用AFM研究DNA分子时，DNA分子的高度是反应DNA信息的最重要指标。液体中的DNA分子高度为2nm。通常，DNA分子在空气环境中测定的高度在0.3-0.8nm，本技术的应用使我们获得了 1.9nm的DNA分子的高度。
DNA分子高度的提高与成像时AFM针尖上的缓冲溶液转移到DNA分子上有关。在制样时DNA分子经历了干燥的过程，当带有缓冲溶液的针尖扫描DNA分子时，针尖上的缓冲溶液就会转移到衬底上和DNA分子上，由此导致DNA分子高度明显增加，但衬底变化较小，使DNA分子与衬底的反差增大，所以图像的对比度有显著的提高。本发明的提高单个DNA分子AFM成像对比度的方法简单方便，且在多种衬底上有效。
实施例2:在Ni离子修饰的云母衬底上增加的DNA对比度成像效果
将新解理的云母衬底用10_3M Ni离子溶液IOul修饰约I分钟后，用蒸馏水将游离的Ni离子冲洗掉，放在干燥皿中备用；
将DNA分子样品溶液滴在镍离子修饰的云母衬底上，利用分子梳技术将DNA分子拉直并固定。将制备好的DNA分子样品用AFM针尖进行扫描成像，如图2a。此图像为DPN前的图像。具体做法如实施例1中描述的一致。
接下来用缓冲溶液修饰的针尖对原来的图像位置进行扫描。AFM针尖(NSC35)用前面提到的TE缓冲液(10_2M Tris-HCl，pH8.3,),并在缓冲液中加入一定浓度的其他物质，如2X IO-3M MgCl2或2X IO-3M CaCl2，修饰1-10分钟后，优选的为I分钟，通过非特异性吸附，部分缓冲溶液吸附于该AFM针尖上。将修饰好的针尖安装在AFM上；采用AFM对原来的地方扫描成像，如图2b，此图像为DPN后的图像。
为了比较对比度变化的效果，对DPN前和DPN后的DNA分子原位图像进行比较。两图像的扫描范围一致，为10 μ mX 10 μ m,高度为3nm。比较两图像，DNA分子的高度增加值在0.1-0.3nm的范围，DPN后的图像(图2b)的对比度比DPN前的图像(图2a)清晰。
前面提供了对较佳实施例的描述，以使本领域内的任何技术人员可使用或利用本发明。对该较佳实施例，本领域内的技术人员在不脱离本发明原理的基础上，可以作出各种修改或者变换。应当理解，这些修改或者变换都不脱离本发明的保护范围。
权利要求
1.种提高单个DNA分子AFM图像对比度的方法，包括如下步骤:(1)修饰云母衬底和制备DNA分子样品，使所述DNA分子固定在所述云母衬底表面上；(2)将所述DNA分子样品安装在AFM仪器上；(3)用水溶液修饰AFM针尖1-10分钟，所述水溶液是含有0.1-1%甘油的水溶液或者TE缓冲液；(4)修饰后的AFM针尖取出后安装在扫描头上，对所述云母衬底上的DNA分子进行扫描成像，扫描时修饰在AFM针尖上的水溶液转移到衬底上的DNA分子上。
2.据权利要求
1所述的提高单个DNA分子AFM图像对比度的方法，其特征在于，步骤(I)中，用KT8-KTkiM的纳米金(Nanogold)溶液IOul修饰云母衬底约I分钟，并用蒸馏水将游离的纳米金冲洗掉。
3.据权利要求
1所述的提高单个DNA分子AFM图像对比度的方法，其特征在于，步骤(I)中，用10_2-10X_7M Ni离子溶液IOul修饰云母衬底约I分钟后，用蒸馏水将游离的Ni离子冲洗掉。
4.据权利要求
1或2或3所述的提高单个DNA分子AFM图像对比度的方法，其特征在于，采用分子梳的方法将所述DNA分子拉直并固定在所述云母衬底表面上。
5.据权利要求
1所述的提高单个DNA分子AFM图像对比度的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述TE缓冲液的浓度是10_2M，pH值是8.3。
6.据权利要求
5所述的提高单个DNA分子AFM图像对比度的方法，其特征在于，所述TE缓冲液中含有1-10_3M浓度的MgCl2。
7.据权利要求
5所述的提高单个DNA分子AFM图像对比度的方法，其特征在于，所述TE缓冲液中含有1-KT3M —定浓度的CaCl2。
专利摘要
本发明公开了一种提高单个DNA分子AFM图像对比度的方法，包括如下步骤修饰云母衬底和制备DNA分子样品，使所述DNA分子固定在所述云母衬底表面上；将所述DNA分子样品安装在AFM仪器上；用水溶液修饰AFM针尖1-10分钟；修饰后的AFM针尖取出后安装在扫描头上，对所述衬底上的DNA分子进行扫描成像。本发明的提高单个DNA分子AFM图像对比度的方法，基于蘸笔纳米刻蚀技术，主要通过利用探针在衬底上扫描时，吸附在探针上的部分水溶液转移到衬底DNA分子上的过程，增加单个DNA分子的高度，从而达到简单有效的提高DNA分子图像的对比度。
文档编号G01Q60/24GKCN101710135SQ200910197713
公开日2013年5月8日 申请日期2009年10月27日
发明者李宾, 胡钧 申请人:中国科学院上海应用物理研究所专利引用 (1), 非专利引用 (3),