专利名称:基于原子力显微镜的自动化dna分子操纵方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA分子技术领域：
的方法，具体地说，涉及的是一种基于原子力显微镜的自动化DNA分子操纵方法。
背景技术：
原子力显微镜(Atomic Force Microscope，AFM)是在纳米尺度上检测样品表面性质的主要工具之一。AFM通过探测针尖与样品表面的相互作用力获取样品表面的形貌，其横向分辨率能够达到0. Inm,纵向分辨率能够达到0. Olnm。由于针尖样品间存在力的相互作用，我们可以通过针尖给样品施加不同大小和方向的作用力，从而实现在纳米尺度上改变样品形貌或性质的目的。DNA分子是生物遗传信息的载体，是生命科学领域最重要的生物大分子之一。传统的生化基因分析方法只能够获得大量分子的统计信息，而基于AFM的纳米操纵技术能够将特定DNA片段进行定位切割分离，提供了获取单个DNA分子信息的可能性。
基于AFM的纳米操纵需要解决的技术难题主要是提高针尖定位的准确性，尤其是在操纵DNA这样尺度在IOnm以下的纳米物体的过程中，针尖定位的准确性是实验成功与否的关键。目前高分辨的AFM的微位移驱动器都采用压电陶瓷材料，优点是位移精度高，响应速度快，但是存在非线性、迟滞、蠕变和热漂移等效应。其中热漂移效应是影响纳米操纵准确性的主要因素(Babak Mokaberi, A. G. Requicha, IEEE transaction on Automation Science and Engineering, 2004, 3 (3)，199-207)。例如在常规的DNA分子手动操纵过程中， 实验人员需要花费大量的时间和精力用于调整针尖的位置补偿热漂移，使得DNA分子的切割分离和拾取需要约8小时的时间，这限制了基于AFM的纳米操纵的效率，不利于单分子纳米操纵技术的推广和标准化。因此，非常有必要发展一套基于高效漂移补偿的自动化DNA 分子操纵方法。
经对现有技术的文献检索发现，Guangyong Li等在《Nanotechnology，2003. IEEE-ΝΑΝΟ 2003. 2003 Third IEEE Conference on》U003 年第三届 IEEE 纳米技 ^ ^ iX) (2003 ^Ξ pp64-67) ± R ^ 的 “Augmented Reality System forReal-time Nanomanipulation"(纳米操纵扩增实境系统)，该文中提出基于原子力显微镜的自动化操纵系统，具体为通过对针尖及针尖-样品相互作用力建立模型，用力反馈操纵系统对纳米尺度物体进行“推动”等操纵。其不足在于该系统由于没有对热漂移进行补偿，针尖的定位的精度约为50 lOOnm。同时由于该系统的操纵控制是基于对目标物体的建模，因此形态较为复杂，力学性质尚未完全清晰的DNA分子而言，操纵难度较大。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于原子力显微镜的自动化 DNA分子操纵方法，克服在纳米操纵过程中热漂移对针尖定位准确性的影响，同时参数设定方便，显著提高操纵效率。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明采用动态/静态混合模式操纵DNA分子。成像时采用动态模式(轻敲模式)，操纵时通过控制扫描管下降一定距离，使针尖振幅减小为零(静态模式)，从而获得足够的操纵力。操纵之前首先计算当前操纵范围的表面倾斜，并在操纵过程中，让针尖的移动始终平行于样品表面。然后基于热漂移变化缓慢的性质，采用图像配准的方法，通过计算连续两幅扫描图像之间的差异，获取当前操纵环境下热漂移大小，并对针尖位移进行补偿，提高操纵精度。最后通过设计针尖移动路径，实现自动化的DNA分子切割分离和拾取操纵。
本发明包括如下步骤
第一步，用AFM对DNA样品成像，选择需要操纵的DNA片段后，以该片段为中心，将扫描范围缩小至<2μπι;
第二步，对该范围进行一次扫描成像，获取样品表面的倾斜。然后，再按照相同的扫描方向(从上至下，或从下至上)连续存储两幅图像。
第三步，根据两幅连续存储的图像数据，计算当前条件下的热漂移大小和方向。
第四步，选择操纵的目标片段及操纵方式。操纵的方式包括切割、推动和拾取，其中切割操纵将目标片段从DNA分子链上分离，推动操纵将目标片段折叠成便于拾取的颗粒状，拾取操纵将折叠的目标片段粘附在AFM针尖上。
第五步，根据热漂移的大小，补偿目标片段的坐标，并根据设定的操纵方式完成 DNA操纵。
本发明通过采用基于图像处理的热漂移补偿技术，将基于原子力显微镜的自动化操纵的操纵精度提高到了 IOnm以下，与DNA分子(理论直径2nm)相当，因而能够实现高精度的DNA分子操纵。同时结合了自动化技术，将DNA分子的操纵时间(单个DNA目标片段切割、推动和拾取的时间)，由手动操纵的数小时，缩短至15分钟以内，显著提高了操纵效率。
图1为DNA分子自动化操纵流程图；
其中(A)扫描获取表面倾斜并连续同方向扫描两幅图像，并选择需要操纵的DNA 片段，如箭头所示；(B)切割操纵结果；(C)从下至上按“Z”字型推动DNA片段，使其折叠成小球状；并设定拾取操纵范围，如图中虚线方框所示；(D)拾取结果。
图2为连续多次DNA自动操纵流程图；
其中㈧扫描获取表面倾斜并连续同方向扫描两幅图像，并选择需要操纵的DNA 片段，如箭头所示；(B)切割分离和拾取第一个420nm的DNA片段，同时选取第二个需要操纵的DNA片段；(C)切割分离和拾取第二个341nm的DNA片段，同时选取第三个需要操纵的 DNA片段；⑶拾取第三个316nm的DNA片段。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例中使用的λ -DNA 分子和 APTES(3-aminopropyltriethoxysiIan)均购自Sigma公司，裸云母购自四川美丰云母工业有限责任公司，封口膜(Parafilm膜)购自 American National Can 公司。
将新剥离的云母表面用的APTES(3-aminopropyltriethoxysilan)进行修饰， 并在120°C环境下烘烤2小时以上。然后在修饰过的云母表面，用“分子梳”技术将DNA分子拉直以便于目标片段的选取。
以下实施例中，各个参数的定义为
a)切割操纵参数
i.切割宽度切割过程中，以操纵点为中心，针尖在XY方向移动的宽度。
ii.切割重复次数针尖在操纵点往返切割的次数。
iii.切割力针尖作用在DNA分子上的力(实际上此参数表示扫描管下降的距
1 ) O
b)推动操纵参数
i.推动宽度推动过程中，以操纵点为中心，针尖在XY方向移动的宽度。
ii.推动步长针尖“Z”字型运动时，每一步的长度。
iii.推动力针尖作用在DNA分子上的力(实际上此参数表示扫描管下降的距
1 ) O
c)拾取操纵参数
i.拾取范围拾取过程中，以操纵点为中心的方形操纵范围的大小。
ii.拾取力针尖作用在DNA分子上的力(实际上此参数表示扫描管下降的距
1 ) O
实施例一
用AFM对DNA样品成像，并选择需要操纵的DNA片段。以该DNA片段为中心将扫描范围缩小至1. 5 μ m。通过一次完整扫描，获取当前扫描范围的样品表面倾斜。然后连续同方向扫描两次，存储两幅图像数据，如图I(A)所示。根据两幅图像计算当前实验条件下的漂移大小和方向。选择一段700nm长度的DNA片段。设定切割操纵参数切割宽度200nm(针尖以切割位置为中心，沿DNA链切线方向，以200nm宽度在XY平面移动)，切割力-18nm(扫描管下降ISnm距离)，切割次数8次(针尖在切割位置往返移动8次)；切割操纵结果如图I(B)所示。然后设定推动参数推动宽度250m(针尖以目标片段为中心轴，以200nm宽度在XY平面移动)，推动力-17nm(扫描管下降17nm距离)，推动步长2nm(针尖沿DNA链轴向按“之”字型移动，步长2nm)；推动操纵结果如图I(C)所示。最后选择拾取操纵范围 IOOnm(以推动后的DNA颗粒为中心，在100X IOOnm范围内进行拾取操纵)，如图1 (C)中虚线方框，拾取力-17nm(扫描管下降17nm距离)。拾取操纵结果如图(D)所示。本例中，操纵精度为3nm，切割操纵的时间约为3秒，推动操纵的时间约为50秒，拾取操纵的时间约为 10秒。
实施例二
用AFM对DNA样品成像，并选择需要操纵的DNA片段。以该DNA片段为中心将扫描范围缩小至1.7μπι。通过一次完整扫描，获取当前扫描范围的样品表面倾斜。然后连续同方向扫描两次，存储两幅图像数据，如图2(A)所示。DNA自动化操纵软件根据两幅图像计算当前实验条件下的漂移大小和方向。首先选择一段420nm长度DNA片段。然后设定切割操纵参数切割宽度200nm，切割力-16nm，切割次数8次；设定推动参数推动宽度250m，推动力-15nm，推动步长2nm ；设定拾取参数拾取范围lOOnm，拾取力-15nm。DNA自动化操纵软件根据热漂移的大小，调整目标片段的坐标，并根据设定的操纵方式及相关参数完成DNA 操纵，如图2(B)所示。按照同样的方法选择另外两段长度分别为341nm和316nm的DNA片段进行操纵，如图2(C)和(D)。由于操纵时扫描范围不变，不需要再次获取表面倾斜，并且由于三次操纵连续进行，热漂移的大小和方向基本不变，也不需要再次计算漂移大小。本例中，操纵精度为7nm，连续三次DNA片段的切割分离和拾取操纵共用时8min。
权利要求
1.一种基于原子力显微镜的自动化DNA分子操纵方法，其特征在于包括如下步骤 第一步，用原子力显微镜对DNA样品成像，选择待操纵的DNA片段后，以该片段为中心，将扫描范围缩小至<2μπι;第二步，对该范围进行一次扫描成像，获取样品表面的倾斜度，然后，再按照相同的扫描方向连续存储两幅图像；第三步，根据两幅连续存储的图像数据，计算当前条件下的热漂移大小和方向； 第四步，选择操纵的目标片段及操纵方式，操纵的方式包括切割、推动和拾取，其中切割操纵将目标片段从DNA分子链上分离，推动操纵将目标片段折叠成便于拾取的颗粒状， 拾取操纵将折叠的目标片段粘附在原子力显微镜针尖上；第五步，根据热漂移的大小，补偿目标片段的坐标，并根据设定的操纵方式完成DNA操纵。
2.根据权利要求
1所述的基于原子力显微镜的自动化DNA分子操纵方法，其特征是，第二步中，所述扫描方向，是指从上至下，或从下至上。
专利摘要
本发明涉及的是一种DNA分子技术领域：
的基于原子力显微镜技术的自动化DNA分子操纵方法，采用动态/静态混合模式操纵DNA分子。成像时采用动态模式，操纵时通过控制扫描管下降一定距离，使针尖振幅减小为零，从而获得足够的操纵力，操纵之前计算当前操纵范围的表面倾斜，并在操纵过程中，让针尖的移动始终平行于样品表面。然后基于热漂移变化缓慢的性质，采用图像配准的方法，通过计算连续两幅扫描图像之间的差异，获取当前操纵环境下热漂移大小，并对针尖位移进行补偿，提高操纵精度。最后通过设计针尖移动路径，实现自动化的DNA分子切割分离和拾取操纵。本发明显著提高了DNA分子纳米操纵的效率，提高了定位操纵的精度。
文档编号G01Q60/24GKCN101435759 B发布类型授权 专利申请号CN 200810204393
公开日2012年6月27日 申请日期2008年12月11日
发明者吕鸣, 孙洁林, 张福春, 胡钧, 龙飞 申请人:上海交通大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),