专利名称：用于评价患牙周炎的危险率的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于测定病人患活性牙周炎或在口腔中患牙周炎的危险率方法的改进。
斑细菌移生到牙齿的侵入处并且引起细菌毒素、酶和可迅速发展成局限在龈组织的炎症(龈炎)的代谢产物。局部宿主组织对细菌病原体的侵入的炎症应答包括在对抗由斑病原体及其产物所带来的组织损伤中担任各种角色的多种类型的细胞(如多形核白细胞、淋巴细胞、血浆细胞、巨噬细胞)的浸润。在许多个体中，斑病原体及与之相关的炎性应答的持续存在导致了牙周炎，包括对用于接合牙齿的结缔组织以及支持牙齿的牙槽骨的进行性损害。
牙周附着器官由牙骨质、牙周韧带和把牙齿连接到牙槽骨的槽部的牙周韧带的组元纤维组成。对健康的牙周而言，牙周正好附着在牙齿釉质及牙根的牙骨质之间的接界的尖端。在临床上，对牙齿上的一个特定部位牙周附着部分的损坏测定是一个校准过的牙周探头测量根牙骨质界与釉质之间的距离和对牙周探针的探测产生机械阻力的牙周袋的基托的水平而完成的。如果存在附着损失，还可能出现牙周袋。如果由牙周病原体移生所致的附着损失的情况继续发展，则可能导致牙槽骨损失。这种组织的损害可能放慢，但是用传统的治疗手段无法逆转。
在患牙周炎的人口中，疾病发展的速度相差很大;此外，对个别的病人，疾病在口腔中的不同部位发展的速度也有很大不同。在口腔中，个别的牙齿及其相应的牙根表面所发生的牙周炎的严重程度有显著的不同。目前，据认为该病的发展模式既可以是随时间呈慢性地线性发展，也可以是按缓解时间区分的疾病活性突然发作的模式。显然，在每一种情况下，对一患者群体作跟踪时间考察时，在临床上可表现出的疾病进行的情况患者的不同及在每个患者口腔中的部位不同会有明显的不同。
检测出发病危险率高的病人和部位可以事先区分出哪些病人和哪此部位是急需治疗的或需要预防性处置的，以便阻止疾病发展到损害组织的阶段。
目前，尚没有有效的手段来评价患持续性的附着损失的病人或部位急性发病的危险率。疾病进行的临床测量可提供早期疾病活性的测量结果，但是并不能提供区分各部位或各患者未来疾病活性水平高低的手段。
对斑病原体的宿主免疫应答包括同时产生出能使龈组织免受侵入的细菌的摧毁作用的分子以及在发生可摧毁牙周组织的宿主应答的分子。例如，淋巴细胞会产生可中和细菌及其有毒产物的阻止斑病原体的抗体。同时，炎性细胞能够释放出各种能分裂并降解关键的牙周组织结构成分中的蛋白质和多糖的水解酶。
为对抗牙周病原体而产生的抗体结合到病原体或它们的产物上，成为抗原-抗体复合体。这些抗原-抗体复合体导致了病原体及其产物的中和和凝集。复合体还通过多形核白细胞(PMN)促进了对病原体和其产物的吞噬作用、杀灭作用和降解。不过，这些抗原-抗体复合体中的一些会因为其激活补体体系的能力而引起次级炎性反应，所述的补体体系是能够激活各种炎性机制的蛋白质水解酶的一个级联。
作为一种水解酶和PMN激活的酶标志的β-葡萄糖醛酸酶(BG)参与了粘多糖/蛋白多糖的酸降解。事实上，据报道，随着牙周炎患者中发生活性牙周炎机会的增加，龈缝流体(GCF)中BG的水平也增加。因此，看来伴随着活性牙周炎，牙周病原体在龈组织之中或周围被PMN衔接的机会也增加了。
由于细菌病原体为发育龈炎和牙周炎所必需，因此测量特定的细菌病原体本身的存在与否并不是预测患活性疾病可能性的足够的或有效的手段。结果，寻找预测未来疾病活性的手段的工作已集中于在在疾病过程中因宿主因子应答而流出的龈缝流体中可见的各种分子的缔合(见Lamster，I.B.等人，缝流体中的酶活性对患慢性牙周炎病的患者中临床附着损失的检测和预测，J.Periodontol.，59，第516-523，(1988)(以后称为Lamster)，及Palcanis，K.G.等人，用弹性硬蛋白酶做为牙周疾病进程的指示物，J.Periodontol.，63，第237-242，(1992)(以后称为Palcanis))。
GCF包括与那些由在龈组织或龈缝中的宿主细胞相同的分子。因此，GCF提供了一个存在于龈组织中的宿主分子的图象，并且可用于指示其中发生的应答和响应。目前的研究正倾向于集中在测量可以与破坏龈组织有关的宿主分子的存在。因此，测量可在龈缝流体中发现的各种炎性介体(例如前列腺素E2)、公认的组织破坏/水解酶(例如β-葡萄糖醛酸酶和弹性硬蛋白酶)以及作为细胞死亡的酶标志(例如天冬氨酸转氨酶)的含量并同牙周附着中测不出临床变化的情况进行比较，以判断这些数据与患活性疾病的危险增加的那些患者或部位的关系(见Lamster和Palcanis)。现已证明这些分子的存在与未来疾病活性的相关性尚未强到使足以成为一种普遍接受和可靠的预测疾病活性的方法。
本发明的一个目的是提供一种检测人类及较低等的动物牙周疾病发生的增加危险率的方法。
本发明的一个进一步的目的是提供用于检测和评价病人或人类或较低等动物中特定牙周位置的疾病发展的危险率的诊断装置。
本发明涉及用于检测或评价目前或以后发生活性牙周炎的危险率的方法和装置，包括(a)采集槽缝流体;(b)测量槽缝流体中IgA的量;(c)测量槽缝流体中多形核白细胞标志物的量;(d)比较步骤(b)与(c)中所得的量与一标准值的比值。
本发明涉及检测人类及较低等的动物中病人或牙周位置患活性牙周炎的危险性的诊断方法。这些方法包括测量GCF中IgA和PMN标志的水平，计算这些值的比率，并且用这个比率估价患活性牙周炎的危险率。出人意料的是，IgA/PMN标志的比值看来反映出了宿主应答机制处于平衡态或非平衡态，从而指示了活性牙周炎发生的可能性。当一病人或一部位的IgA/PMN标志的比值低于没有患活性牙周炎的危险率的病人或部位中的所得的IgA/PMN标志的比值时，该病人或部位患活性牙周炎的危险率在增加。
“牙周附着”在此处指支持牙槽骨的槽中的牙齿的结缔组织的附着。
“牙周炎”一词在此处指包括牙周附着和/或牙槽骨吸收在内的破坏组织的疾病。
“龈组织”在此处指牙龈组织和环绕牙齿和牙槽附着和牙槽骨的粘液膜。
“龈缝”在此处指同牙周附着的水平有关的、位于自出龈的内侧部分与牙釉质或与牙骨质之间的空间。
“牙周槽”指与由龈附着向牙根的尖移行引起的牙周疾病有关的、异常深的龈缝。
“活性牙周炎”在此处专指一种牙周炎，其中发生了临床上可检测得到的结缔组织附着损失和/或牙槽骨吸收的增加。
“非活性牙周炎”在此处指不可检测出结缔组织附着损失和/或牙槽骨吸收的增加的疾病。
“龈缝流体”和“GCF”在此处指从自由龈中的毛细管漏流所产生的在龈缝中采集的血浆漏出液。
“龈炎”在此处指龈组织的炎症。
“疾病”在此处指牙周炎。
“部位”在此处指为检查牙周炎的有无而监视的牙周围特定的位置(如在牙根的正中、远中、颊向或舌向表面)。
“标志”在此处指可以检测和测量并且可指示是否存在一个或多个与疾病病理学机理相关的一个或多个特异性的分子。
“IgA”在此处指血清型免疫球蛋白A。
“PMN”在此处指多形核白细胞。
“GCF样品”在此处指从一个部位或一个患者的龈缝所采集的相当数量的GCF。
“GCF试验样品”在此处指稀释进一个标准体积的缓冲液中的GCF样品，从所述的缓冲液中取出多个等分量用于随后的GCFIgA或GCFPMN标志的分析。
“GCFIgA”在此处指在一个GCF试验样品中检测出的龈缝流体血清型IgA。GCFIgA包括IgA1及IgA2同位素，并且不限于对特定的抗原特异的IgA抗体。
“GCFBG”在此处指在一个GCF试验样品中所检测到的活性β-葡萄糖醛酸酶的量。
“GCFPMN”在此处指从龈组织移生进龈缝的龈缝多形核白细胞。
“PMN标志”在此处指用于一GCF试验样品中所检测到的活性多形核白细胞的多种特定的标志中的任何一种。
“GCFPMN的活化”在此处指GCFPMN与龈缝、牙周袋或牙周组织中的细菌的应答过程，所述的应答形成了对PMN代谢产物、酶和/或副产品的加工。
患活性疾病的危险率与IgA/PMN标志的比值的相关性大小依赖于所选择的PMN标志。一些IgA/PMN标志的比值相对于其他的比值而言是更可靠的预测值。用于本发明目的的待测的适用的PMN标志包括那些代表PMN活化和去粒水平的标志。这些标志包括(但不限于)β-葡萄糖醛酸酶、水解酶、弹性硬蛋白酶、组织蛋白酶(如组织蛋白酶B/L及组织蛋白酶G)以及明胶酶，反映PMN的早期活化事件的髓过氧化物酶胶其代谢产物(如LTB4或LTC4)。优选的PMN标志为弹性硬蛋白酶和β-葡萄糖醛酸酶。
可以用很多种方法得到GCFIgA/PMN标志比，这些方法包括用一个GCF样品中所存在的GCFIgA的总量除以一个GCF样品中所存在的PMN标志的总量;用GCF试验样品的一个标准可分量中所存在的GCFIgA的总量除以GCF试验样品的一个标准可分量中所存在的GCFPMN标志的总量;用一个GCF试验样品中所存在的GCFIgA的浓度除以该GCF试验样品中所存在的GCFPMN标志的浓度;或者用GCFIgA的浓度除以GCFPMN标志的浓度。
可以用多种方法采集GCF。其中，这些方法包括Lamster、Hartley和Vogel等人的“关于龈缝流体的生化技术的进展”，J.Periodontology，56(增补)13-21，(1985)(以后称为LamsterⅡ)，在此引入以供参考。通过采用上述那些采集方法，可以获得GCF样品。
测量GCFIgA的方法有许多方法可以用来测量GCF样品中IgA的含量。这些方法包括(但不限于)采用酶连接免疫吸着测定(ELISA)技术的测定法，或者用作为检测系统的放射免疫法(RIA)测定法。
用ELISA进行GCFIgA测量的方法见Sengupta等人，治疗对患慢性牙周炎的成年患者的龈缝液体中的IgG、IgA、IgM和α-2-巨球蛋白的作用，Arch.Oral.OralBiol.，33，No.6，第425-431页(1988年6月)(以后称为Sengupta)，这篇文献在此引入以供参考。这些叙述的方法以及改进了的ELISA法采用了一种非人类(最好是非灵长类)抗人类IgA“俘获”抗体，该抗体是一种多克隆或单克隆抗IgA抗体制剂。所用的俘获抗体对IgA特异并且不与人类IgG、IgM、IgE或IgD发生交叉反应。
此抗IgA“俘获”抗体通常可与一种固体支持器(如一种微滴定培养板)或与一种颗粒基质(如胶乳)发生交联。
在对试验样品培养期间，此“俘获”抗体从GCF已溶解进的试验样品缓冲液或直接从GCF样品本身俘获GCFIgA，并且把它保持在用于有关的免疫测定试验中的固体支持物/颗粒基质上。然后可以将所俘获的IgA从剩下的GCF样品成分中分离出来，分离的方法通常可以是轻洗GCFIgA所复合的表面或者过滤俘获IgA所复合的颗粒状复合体。接着使所俘获的抗体-GCFIgA复合体暴露于一种抗体酶轭合物(如过氧化物酶-轭合的兔IgG)。
这种抗体-酶轭合物中采用了一种对人类IgA免疫球蛋白特异的、并且不与抗体-IgA俘获抗体交叉应答的抗体。此抗体通常与一种产色酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶或糖苷酶)或与生物素相轭合/连接。如果发生生物素化抗体与所俘获的IgA复合，随后再用一种抗生物素抗体-酶轭合物(例如用一种上述的产色酶)或一种抗生物素蛋白-产色酶轭合物进行培养。然后可将上述俘获-抗体-IgA-抗体-产色酶复合物暴露在适用于相应的轭合酶(如分别用于HRP和碱性磷酸酯酶的邻苯二胺二盐酸盐和对硝基苯酚磷酸酯)的产色底物。然后在一种适当的缓冲液中培养这个混合物，使发生一种产色反应，该反应的吸收和/或强度正比于被俘获抗体所束缚的IgA的量(关于ELISA方法的背景，见Notermans，S.等人，用酶连接免疫吸收测定法(ELISA)检测和确定肉毒梭菌毒素A、B和E，METHODSINENZYMOLOGY，84，pp223-238，(1984)(以后称为Notermans);Butler，J.E.，放大的ELISA;在生化分离中相当数量的纲和亚纲的抗体以及抗体分布及抗原方面的原理和应用，METHODSINENZYMOLOGY，73，第483-523(1981)(以后称为Butler);SigmaImmunoChemicalsCatalog1992(SigmaChemicalCompany)，(以后称为Sigma);Engvall，E.等人，酶连接免疫测定法，ELISA，Ⅲ.由酶标志抗免疫球蛋白对涂覆抗原的管中特异抗体进行定量化，J.OFIMMUNOL.109，pp，129-139(1972)(以后称为Engvall);Kato，K.等人，酶联免疫测定免IgG的FAB片段与大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的结合及其免疫测定应用，J.OFIMMUNOL.116，第1554-1564(1976)(以后称为Kato);及Guesdon，J.L.，磁性固相酶免疫测定法用于对抗原和抗体的定量化人类免疫球蛋白E的应用，METHODSINENZYMOLOGY，73，第471-482，(1981)，在此引入每一篇文献以供参考)。
适用的非人类“俘获”抗体包括从鼠、兔、豚鼠和山羊得到的抗血清(见Sengupta和Butler)。
适用的固体支持器包括聚苯乙烯，滤纸、硝化纤维素、尼龙、铁磁珠和溴化氰活化纸。聚苯乙烯和硝化纤维素最为优选(见Butler;PappasM.G.，点型ELISA在免疫寄生物学中最新的用途，VET.PARASITOLOGY，29，第105-129，(1988);LehtonenO.P.等人，ELISA中的抗原附着，J.IMMUNOL.METHODS，34，第61-70，(1980);Smith，K.O.等人，磁传送装置在固相放射免疫测定法和酶连接免疫吸收测定法中的应用，J.INFECT.DIS.，136，第S329-336，(1977);Hendry，R.M.等人，用尼龙耦合的酶连接免疫测定法对流感抗原的检测和鉴定，J.VIROL.METHODS，6，第9-17，(1983)(以后称为Hendry);Maiolini，R.等人，酶免疫测定的叠层法。I.在鼠和人类α-胎儿蛋白的应用;J.IMMUNOL.METHODS，8，第223-234，(1975)，以及SamantaA.K.等人，用硝化纤维素盘作为固相对睾酮的免疫测定，J.CLIN.CHEM.BIOCHEM.28，第943-947，(1990)，在此引入每篇文献以供参考)。
可以使用的颗粒基质包括聚苯乙烯、胶乳、尼龙、磁珠、玻璃、琼脂糖和琼脂糖。串珠状的聚苯乙烯和胶乳最为优选(见NilssonB.，一种用于放大ELISA的通用试剂，J.Immunol.Methods，114，第89-93，(1988);Henry;Gundersen，S.G.，磁珠抗原俘获，用于血吸虫阳极抗原的快速检测的微滴定盘中的酶连接免疫测定法，J.Immunol.Methods，148，第1-8，(1992);Oku，Y.，用高灵敏珠的ELISA法检测细菌蛋白质毒素的进展，Microbiol.Immunol.，32，第807-816，(1988);以及Harada，T.等人，用酶连接免疫吸收测定法检测对B类嗜血杆菌流感的囊特异性多糖特异的粘膜和血清抗体，Microbiol.Immunol.29，第591-600，(1985);及Sigma，在此引入每篇文献以供参考)。
适用的抗体酶轭合物及俘获抗体对包括与辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶或糖苷酶、碱性焦磷酸酶或脲酶轭合的IgG或IgM同型的小鼠、山羊和兔抗人类IgA抗体(见Sigma;Notermans;Butler;Kato;Engvall;及Cerrone，M.C.等人，用于有限稀释微培养分析的脲酶基微ELISA法的介绍，J.Immunol.Methods，138，第65-75，(1991)(以后称为Cerrone)，在此引入以供参考)。
适于与HRP和碱性磷酸酯酶及脲酶相轭合的适用的产色底物包括邻苯二胺二盐酸盐、对硝基苯酚磷酸酯及脲分别加上一种pH指示剂(见Notermans;Butler;Cerrone和Sigma)。
用于本发明的合适的缓冲剂尤其包括磷酸盐(0.001-0.1M)缓冲(pH＝6.6-7.4)盐水溶液(0.10-0.20NNaCl)加上吐温(0.01%-0.1%)(即PBST)。优选的缓冲剂为PBST，包括pH为7.01的0.01M磷酸盐缓冲剂加上含有0.05%吐温的0.15N的盐水溶液。
用于本发明的ELISA还可以在溶液中进行，其中用目视法观察显色反应以给出所存在的IgA的水平。还可用生色的酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶和脲酶)来进行这些显色反应，还可以同产荧光的底物偶合(见Notermans;Butler;Sigma和Magnusson，K.E.等人，用于定量分析对食物抗原的抗体的荧光连接免疫吸收测定法(FLISA)，Immunol.Invest.，16，第227-240，(1987)，在此引入以供参考)。
利用分光光度装置或通过采用目视测定法，可以用这些显色测定法来进行定量评估。这些测定法可包括采用包括一种酶-抗体轭合物及其相应的产色底物的PBST溶液。可以把这些溶液颜色的变化同由相应于特定浓度的IgA在标准试验样品中所引发的产色底物的颜色变化的一系列颜色标准的图进行比较。通过将颜色的改变同相当的颜色标准进行对照，可以确定试验样品中IgA的水平。
当采用辣根过氧化物酶时，上述抗体轭合物的相应的产色底物可以包括邻苯二胺二盐酸盐;当采用碱性磷酸酯酶时，可以包括对硝基苯酚磷酸酯;并且当采用脲酶时，可以包括脲加上一种pH指示剂。
可以按下述方法建立一系列颜色标准对包括IgA浓度范围已知的多个标准试验样品进行一系列比色测定，然后通过使颜色标准与强度和/或吸收相对照以建立这些颜色标准。这些颜色标准可以呈能代表一定范围的颜色强度/吸收的某种形式的图，所述的颜色强度/吸收相应于一个在试验样品中可以发现的很宽范围的IgA浓度。
这些免疫测定法可以与固相支持器、微珠、凝胶、其它颗粒物或滤器联合使用，其中颜色改变的最终产品被俘获在一个固相支持器上。
适用的固体支持器包括聚苯乙烯、滤纸和硝化纤维素。聚苯乙烯和硝化纤维素最为优选。
可以采用的颗粒基质包括聚苯乙烯、胶乳、尼龙、磁珠、玻璃、琼脂糖和琼脂糖。串珠状聚苯乙烯和胶乳较为优选。
如上所述的溶液测定法，对GCFIgA水平的目视定量测定是通过将GCF样品的比色反应强度与代表GCFIgA水平范围的一系列颜色标准进行比较而确定的。
可以按下述方法建立一系列颜色标准对包括IgA浓度范围已知的多个标准试验样品进行一系列比色测定，然后通过使颜色标准与强度和/或吸收相对照以建立这些颜色标准。这些颜色标准可以呈能代表一定范围的颜色强度/吸收的某种形式的图，所述的颜色强度/吸收相应于一个在试验样品中可以发现的很宽范围的IgA浓度。
测量试验样品中由GCF而来的IgA的另一个方法是放射免疫测定法(RIA)。Nerenberg和Prasad，MethodsinEnzymology，73，IMMUNOCHEMICALTECHNIQUESPartB，第666-691(1981)中介绍了此方法的一个例子，在此引入此文以供参考。
测量GCFPMN标志的方法活化的PMN存在的标志包括β-葡萄糖醛酸酶、水解酶、弹性硬蛋白酶、组织蛋白酶(如组织蛋白酶G和组织蛋白酶B/L)，以及反映PMN早期活化活动的明胶酶、酶髓过氧化物酶及其代谢产物(如LTB4或LTC4)。优选的PMN标志为β-葡萄糖醛酸酶(BG)和弹性硬蛋白酶。
可以用各种方法测定BG，这些方法包括(但不限于)比色法和荧光分析法。
LamsterⅡ中介绍了测量BG的比色法。这些比色测定法包括测量从酚酞葡糖醛酸中释放出的苯基酞。可以用这些测定法来定性及定量地确定GCFBG的水平，比如用分光光度法或采用目视测定法。
可以用分光光度法来确定GCFBG的水平，步骤包括将一个等分量(50ul)的试验样品加入到100ul的0.075M的乙酸盐缓冲液(pH4.5)、50ul的0.15MNaCl盐水和50ul的0.03M的酚酞葡糖醛酸(pH4.5)，并且在56℃下培养2小时。加入350ul的0.1M2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液(pH11)以终止反应。测量在550um处相对于试剂空白的吸收，并且与一个酚酞标准曲线进行对照。用这些结果来计算每个GCF试验样品中BG的水平。
可以用目视测定法通过一种改进了的上述的分光光度测定法来确定GCFBG的水平。具体地说，可以按上述方法分析试验样品，直到加入2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液为止。同时，将目视的颜色吸收/强度与代表BG标准曲线的吸收/强度范围的颜色图进行比较。将试验样品的目视颜色强度/吸收值与标准曲线进行对照;以给出GCF试验样品中BG的水平。
对上述试验的一个进一步的改进是用产色底物对硝基苯基β-D-葡糖苷酸代替酚酞葡糖醛酸。在这种情况下，水解时BG所释放出的黄颜色可做为试验样品中BG水平的一个量度。
可用荧光测定分析法对GCFBG进行定量分析，如Pope，M.等人在J.DentalResearch，70，Abstract704，1991年4月中所述，在此引入该文以供参考。荧光分析测定法包括对荧光分子的β-葡糖醛酸衍生物所释放出的荧光副产品进行分光光度/目视测量。对BG的荧光测定法已可用于其他用途。这些测定法见Papasian等人的“用一种产荧光的β-D-葡糖醛酸酶测定法对大肠杆菌的快速鉴定，DIAG.MICROBIOL.INFECT.DIS.，8(4)，第255-8，(1988年12月)，在此引入以供参考。如LamsterⅡ中所述，通过用产荧光的前体底物4-甲基7-羟基香豆素基-β-D-葡糖醛酸化物代替酚酞葡糖醛酸，然后通过BG释放出的荧光副产品(4-甲基-7-羟基香豆素)的量评价BG的水平，可以将这些技术用于检测GCF中的BG。测定所释放出的荧光副产品水平的方法是将待测物暴露在360nm紫外光下，并且将所得的荧光强度与包括已知BG浓度的各种试验样品标准曲线所显示的强度进行比较。
通过采用一种酶俘获测定法，也可以检测出GCFBG的水平。这些方法的例子见Holt等人的《用于快速检测特蛎中大肠杆菌的酶俘获测定法》，55，(1)，第229-32，(1989年1月)，在此引入以供参考。将这种技术应用于检测试验样品中GCFBG的步骤包括制备对人类BG(与大肠杆菌BG相反)的抗体制剂，并且将抗人类BG抗体制剂附着在一个微滴定板或其他适当的表面。随后，与LamsterⅡ中所述的情况相同，加入试验样品并且进行培养。
可以用各种方法来测定GCF弹性硬蛋白酶的含量，这些方法包括(但不限于)比色测定、ELISA以及荧光分析法。一般而言，这些测定法包括从被弹性硬蛋白酶特异的水解的衍生肽中释放出产色的或产生荧光的化合物。
可以用比色和荧光测定法来定量确定GCF弹性硬蛋白酶的水平，比如，通过分光光度法及通过目视测定法。
荧光分析法包括对从荧光分子的肽基衍生物释放出的荧光副产品进行分光光度/目视测量。各种测量GCF弹性硬蛋白酶水平的荧光分析法见Cox，S.W.和EleyB.M.，用7-氨基-4-三氟甲基香豆素的肽基衍生物检测牙周炎患者的龈缝流体中组织蛋白酶B-和L、弹性硬蛋白酶、类胰蛋白酶、胰蛋白酶及二肽基肽酶Ⅳ类活性，J.PERIO.RES.，(24)，353-361，(1989)(以后称为CoxⅠ)以及在Cox等人的“用于测定龈缝流体中的蛋白酶的一种简便的组合的产荧光的和产色的方法，J.PERIO.RES.，(25)，164-171，(1990)(以后称为CoxⅡ)，在此引入这两篇文献以供参考)。
测量GCF样品中PMN弹性硬蛋白酶水平的适用的比色分析法见CoxⅡ，AsmanB.，PeripheralPMNcellsinJuvenilePeriodontitis;IncreasedReleaseofElastaseandofOxygenRadicalsafterStimulationwithOpsonizedBacteria.，J.CLIN.PERIODONTOL.，(15)，360-364，(1988)(以后称为Asman)，以及Kramer等人的“MeasurementofFreeHumanLeukocyteElastase/alpha-1ProteinaseInhibitorComplexedbyanEnzyme-LinkedImmunosorbentAssay”，J.IMMUNOLOGICALMETHODS，(131)，41-48，(1990)(以后称为Kramer)，SuomalainenK.的“CharacteristicsofNeutralProteasesinInflamedHumanGingiva”，SCAND.J.DENT.RES.，(97)，346-354，(1989)(以后称为Soumalainen)，以及Palcanis，在此引入这些文献中的每一篇文献以供参考。
GCFIgA/PMN标志比的确定可以计算某个患者或某个部位的GCFIgA/MPN标志比。为确定某一个别患者患牙周炎危险的等级，需确定取自每个有关部位的每个GCF样品的GCFIgA和PMN标志的水平，并且随后确定取自每个有关部位的每个GCF样品的GCFIgA/PMN标志比。反过来，可以计算取自口腔中所有试验部位的GCF样品的IgA/PMN标志比的平均值，得到对于给定的患者的IgA/PMN标志比。
GCFIgA/PMN标志比的绝对值是所测的特定的PMN标志、所用的检测系统以及用于表示这些结果的单位的函数。GCFIgA可以表示为GCF中所存在的IgA的质量(如ng/样品)、每个样品的ELISA单位的总数(如吸收单位)、每个样品的RIA单位或用于目视ELISA测定的标准标度的分值。例如，PMN标志、BG和弹性硬蛋白酶可以表示为酶单位/样品，或表示为用于目视酶俘获测定的标准标度的分值。采用IgAELISA单位(如每个样品的吸收单位)将给出一个与采用每个样品IgA的ng数不同的代表GCFIgA/BG比的绝对值。这些，对本发明的每个实施例而言，须将所述的计算结果校准为特定的值以用于表示所检测的IgA/PMN标志的水平。
IgA/PMN标志比的校准测量IgA和PMN标志的浓度的结果所参照的比较标准可以通过临床试验来加以确定。一种获得一个标准的方法是要纵向评价正常的健康患者和牙周炎患者的群体以便根据各个IgA/PMN标志比在随后的临床参数中变化校准相应的IgA/PMN标志比。给定一个用于GCFIgA和PMN标志浓度的定量化特定的装置，可以采用从上述群体得到的IgA/PMN标志比，估计统计标准方差，以便将某一标志比范围分成代表低、中、高活性牙周炎的发病率。
可以在研究过程中登记多个牙周健康患者组(即牙袋深度不超过4mm并且有关部位的附着损失不大于2mm)以及多个成人牙周炎患者组。可取的是每个组中至少有10个患者较好;更可取的是每组中至少有40个患者。在每个患者的一系列预定的试验部位采集GCF样品，可取的是每个患者至少采集2个部位时。更可取的是每个患者至少采集2个部位时更好。然后用上述一个或多个特定的测定方法(或其他方法)确定GCFIgA和PMN标志的水平。然后对每个患者口腔中每个特定部位进行基线临床测量，如测量牙周附着水平或牙槽骨高度。然后可对患者进行给定的常规牙周保持护理，如进行刮牙和牙根修整，并且指导他们在一个标准时期(最好约6-12周)内保持他们正常的口腔卫生习惯。指定的时期过后，召集所有的患者，并且确定他们相应的牙周附着损失水平。疾病进程达到有意义的水平的那些患者和部位被认为是活性疾病患者/部位。疾病进程达到有意义的水平的标志可以是损失增加，如至少一个部位的附着损失超过2mm并且/或骨损失达到一个可观的水平(即损失大于所用的测量手段的统计偏差)。为确定将个体患者的比值所进行比较的标准，计算患活性疾病的患者组和未患活性疾病的患者组GCFIgA/PMN标志比的平均值。(以后将这些值分别称为“活性组平均值”和“非活性组平均值”)。对于一个有效的标准，非活性组平均值与活性组平均值之间的差值必须大于它们的标准偏差之和。为确定将个体部位的比值所进行比较的标准，另外还须计算患活性疾病的部位及未患活性疾病的部位的平均GCFIgA/PMN标志比(以后称这些值为“活性部位平均值”和“非活性部位平均值”)。对于一个有效的标准，非活性部位平均值与活性部位平均值之间的差别必须大于标准偏差之和。
其后，当采用同样的IgA和PMN标志测定法时，将平均总的口腔IgA/PMN比值高于一个低于非活性组平均值的标准偏差的任何患者称为低危险患者。与此相似，将平均总的口腔IgA/PMN比值低于一个高于非活性组平均值的标准偏差的任何患者称为高危险患者。将那些平均总的口腔IgA/PMN比值在一个高于活性组平均值的标准偏差和一个低于非活性组平均值的标准偏差之间的患者称为中等危险患者。
与此相似，当采用与用于确定活性和非活性部位手段相同的IgA和PMN标志测定法时，将平均总的口腔IgA/PMN比值高于一个低于非活性组平均值的标准偏差的任何部位称为低危险部位。与此相似，将平均总的口腔IgA/PMN比值低于一个高于非活性组平均值的标准偏差的任何部位称为高危险部位。将那些平均总的口腔IgA/PMN比值在一个高于活性组平均值的标准偏差和一个低于非活性组平均值的标准偏差之间的部位称为中等危险部位。
诊断装置本发明还涉及检测或评价人类或较低等动物中目前或以后患活性牙周炎的危险率的诊断产品。这些诊断产品包括一个用于测量存在于所诊断的人类或较低等动物口腔中一个或多个部位中的龈缝流体中所存在的IgA量的装置和一个用于测量PMN标志的量的装置。
这类诊断产品的一个例子是用于检测和评价人类或较低等动物中的患者或部位疾病发展的危险率的诊断用品。
一种用于确定患者/部位的IgA/PMN标志比的诊断用品包括确定IgA和一种指定的PMN标志的存在所必需的材料。
对分光光度ELISA分析而言，此诊断用品内必须包括一种采集一个或多个GCF样品的装置以便可以得到IgA和PMN标志中GCF水平的测量结果。为实现此目的，所述的用品可包括多个预先切割好的滤纸块、毛细管、毛细吸管、微量吸管、冲洗龈缝的试剂(例如，与微珠、凝胶或磁性颗粒交联以从龈缝中收集IgA和BG的特定的抗体)。
为分析IgA，用品可包括容器、试管、培养管、试剂瓶以及含有缓冲盐水溶液的微型离心管，所述的缓冲盐水溶液包括必要的试剂并且/或者为检测GCFIgA的存在所制备的样品和所进行的测定都是在这些溶液中完成的。这些组分可包括缓冲范围为pH＝6.6-7.4的磷酸盐(0.001-0.1M)、NaCl(0.10-0.20N)以及吐温(0.01-.10%)(即PBST)，并且PBST溶液包括必要的试剂和产色底物。最好PBST包括0.01M的磷酸盐缓冲剂(pH＝7.01)、带0.05%吐温的盐水(0.15NNaCl)。
诊断用品还可包括进行测定所需的培养容器。适用的培养容器可包括试管、培养管、小杯和微滴定板。优选的培养容器为微滴定板。培养容器为96凹坑的聚苯乙烯微滴定板更好，比如可以是Nunc型免疫板1(丹麦的Roskilde)。
诊断用品还可包括一个用于从试验样品中俘获IgA并且在ELISA(如抗血清)的发育过程中把它保持在微滴定井的底部的装置。适用的抗血清可包括非人类的抗人类IgA“俘获”抗体，如多克隆或单克隆抗IgA抗体制剂，它对IgA特异并且人类IgG、IgM、IgE或IgD交叉反应。抗血清取自非灵长类较好，最好取自山羊抗人类IgA。更为优选的是山羊IgG抗人类IgA抗血清和一种碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(最好为pH9.6的0.1M的缓冲溶液)。在4℃下将俘获抗体在多个微滴定板中的碳酸氢盐缓冲溶液中培养48小时，以使俘获抗体附着在微滴定板凹坑的底部。
诊断用品中可能需要包括一种被诱导的抗血清以利于检测由俘获抗体所保持的IgA。最好被诱导的抗血清为上述的那类未标志的抗血清。适用的标志可包括酶标志(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶或脲酶)、生物素标志、放射标志和荧光标志。优选的抗血清为辣根过氧化物酶标志的山羊IgG抗人类IgA。
如果所述的用品包括一种生物素标志的抗IgA抗血清，那么在PBST缓冲溶液中还可包括一种抗生物素蛋白标志的轭合物。抗生物素蛋白标志的轭合物特异地与抗生物素结合并且使得可用IgA和俘获抗体检测生物素标志的抗IgA抗血清复合物。在轭合物中的抗生物素蛋白上的适用的标志包括酶标志(如带有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶的酶标志)、放射标志和荧光标志。优选的抗生物素蛋白标志的轭合物是一种抗生物素蛋白酶轭合物，最好是一种抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶轭合物。
为通过产生一种可见的色基而检测IgA俘获抗体复合物，诊断用品还可包括一种含有一种生色团体系的缓冲溶液。适用的生色团体系包括正邻苯二胺和对硝基苯酚磷酸酯。如果缓冲液包括邻苯二胺，那么它还可包括约0.01%-1%的过氧化氢。
为使pH值保持在一个人类PMN标志实现最佳的酶机能相一致的范围，诊断用品可包括一种缓冲溶液。适用的缓冲包括pKa处于pH4.9周围0.5pH单位的缓冲溶液，比如一种乙酸盐缓冲溶液。优选的缓冲溶液是醋酸钠缓冲溶液。如果采用的是乙酸盐，优选的浓度在约0.01M-约0.5M之间。缓冲溶液优选的pH在约4.5-约5.5之间，最好在约4.9左右。
诊断用品还可包括一种可与聚苯乙烯或其他固体支持器(如滤纸、硝化纤维素、凝胶、微胶囊或微珠)连接的抗血清β-葡糖醛酸酶抗体。优选的情况是，抗人类BG抗体连接到聚苯乙烯上，连接到聚苯乙烯微滴定板上更好。
为检测人类BG的存在，用品还可包括一种用于人类BG的产色底物。这类底物包括β-D-葡糖醛酸的轭合物，如酚酞葡糖醛酸，4-硝基苯基β-D-葡糖苷酸以及4-甲基-7-羟基香豆素基-β-D-葡糖苷酸。优选的底物为酚酞葡糖醛酸。如果用品中包括了酚酞葡糖醛酸，最好以pH为约4.5至约5.5的状态提供这种酸。
诊断用品还可包括一种盐水溶液，以便用这种溶液在IgA的ELISA测定法的各个培养步骤之间冲洗来自ELISA板的试剂。适用的盐水冲洗溶液包括磷酸盐缓冲的盐水吐温溶液。
也可以将一种HCl溶液加入到ELISA反应中，以便在用分光光度测定法读取吸收值时使反应终止。这些，用品还可包括一种HCl溶液，用它来终止ELISA测定工作。所述的HCl溶液最好为浓度约为0.1M的溶液。
为终止BG的测定，用品中有必要包括一种缓冲剂。适用的缓冲剂包括氨基醇，如2-氨基-醇。优选的缓冲剂为2-氨基-2-甲基-1-丙醇。优选的缓冲液为浓度为约0.01M至约1M的水溶液，浓度为约0.1M更好。缓冲液的pH值为约9-至13，为约11更好。
在诊断用品中包括这些用于相应测定的标准曲线是有用的。这些标准曲线可以将用例如吸收单位和色强度获得的相应的IgA和PMN标志测定的数据转换成试验样品中的IgA和PMN标志的水平。因此，用相应的测定单位(例如吸收单位和色强度)的数据可以表示为水平或浓度(例如IgA为mg/ml或μg/μl或PMN标志活性为单位/ml)(例如吸收单位或色强度)的函数。标准曲线可以通过制备代表GCF中IgA和PMN标志浓度的整个范围的标准试验溶液，然后通过进行相应的IgA和PMN标志的比色测定并且将结果图示的方式测定那些标准溶液来得到。这样的曲线可以表示为对应于标准试验测定的吸收值的图形，这个图形作为相应的测定结果对由附加到相应的试验样品上的等级所表示的IgA和PMN标志的浓度的关系曲线。
方法和诊断用品的例子下列非限定性例子以举例的方式说明了本发明内容的相应的方法和诊断用品。
例1下面是本发明方法的一个代表性的例子。
测定患活性疾病的危险率的分光光度法包括首先在每个牙周炎患者的16-20个部位采集GCF样品。采集工作是按照LamsterⅡ中所述的操作进行的。
随后是按照Sengupta中所述的方法对GCFIgA水平的分光光度分析;按照LamsterⅡ中所述的方法对GCFBG水平的分光光度分析。然后计算IgA/部位的平均值(如每30秒所采集的GCF中IgA的ng数)以及BG/部位的平均值(如每30秒所采集的GCF中BG活性的单位)。再计算每个患者IgA/BG比的平均值[(即对每个目标准(平均的IgA/部位)/(平均的BG/部位)]。
举例来说，用上述方法从一个患者(“MG”)采集GCF，然后测定该患者的平均IgA/GCF样品/部位为45ng，而平均BG/GCF样品/部位为2.3单位。再通过计算确定该患者MG的平均IgA/BG比为19.6。
采用与上述相同的分光光度测定法进行的临床研究表明，患活性牙周炎的患者的平均IgA/BG比为21.1±7.2;而没有出现附着损失的患者的平均IgA/BG比为125.2±46.6。
用临床研究结果作为标准，并且将MG比值与所述标准进行比较，患者MG的IgA/BG比值低于上述的那些患活性牙周炎的目标值的平均值的一个标准偏差。这样，MG患者处在患活性牙周炎的高危险率区(或然率大于80%)。
例Ⅱ下面是说明本发明方法的另一个例子，并且是对IgA和BG测定的一种目视定量方法。
按照LamsterⅡ中所述方法采集GCF;按照Sengupta所述方法进行GCFIgA的测定，所不同的是通过将所测定的溶液的颜色的改变与代表GCFIgA浓度范围的一个标准系列的颜色强度进行比较来评价产色反应。
用LamsterⅡ中所述方法来进行GCFBG的分析，所不同的是通过将所测定的溶液的颜色的改变与代表在人类GCF中所发现的GCFBG水平的范围内BG产色反应的一个标准系列的颜色强度进行比较来评价BG的水平。
这些比较颜色改变的颜色标准是通过对一系列试验样品进行IgAELISA和BG酶测定而得到的。每个试验样品包括不同的已知浓度的IgA和BG，以及代表一个宽范围IgA和BG浓度的系列物。然后将每个相应的样品的产色的颜色反应与包括适当的染料的个别的溶液相对照以得到一系列与所试验的IgA和BG样品颜色相同的溶液，进而得到一系列代表不同IgA和BG浓度的有色溶液。此系列溶液是同从待估价牙周炎发病危险率的患者所采集的GCF样品所进行的产色的颜色反应测定结果相比较的颜色强度标准。
通过将由所测的GCF样品所得的IgA和BG颜色强度与一个基质表上的相应的颜色标准进行对照，可以确定IgA/BG比，所述的矩阵表的Y轴代表人类GCF中所发现的BG浓度的增加，其X轴代表IgA浓度的增加。由相应的“X”和“Y”值所确定的矩阵表上的点落在一个危险率将为高、中等或低的区域中;代表低IgA/BG比的、离Y轴较低的三角形区域代表较高的危险率。
例Ⅲ下面是本发明的一个用品的一个有代表性的例子。
一个用于IgA/BG分析的分光光度用品被指定与一个微滴定板读出器和一个分光光度计一同使用以便读出测定结果。
为了采集GCF，用品包括20个预裁好的滤纸带。
为了分析GCFIgA部分，用品包括20个包括PBST(0.01M磷酸盐缓冲的、pH为7.01的0.15N的NaCl盐水，带0.05%的吐温)的微离心管50mlPBST冲洗溶液;4个微滴定板;10ml在0.1MpH为9.6的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲剂中稀释成1∶256000的山羊抗人类IgA抗血清;10ml过氧化物酶标志的山羊抗人类IgA，在PBST缓冲剂中稀释为1∶4000;10ml的0.1M包括30mg邻苯二胺与0.3%过氧化氢的柠檬酸盐缓冲溶液;10ml的0.1MHCl溶液，以及一个IgA测定用的标准曲线。
为了测定BG部分，用品包括10mlpH为4.9的0.075M乙酸盐缓冲溶液;5mlpH为4.5的0.03M酚酞葡糖醛酸溶液;5ml0.15N的NaCl盐水溶液;50mlpH为11的0.1M的2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲溶液;以及一个用于测定BG的标准曲线。
用品还包括一个矩阵表，其中所标定的X轴代表IgA水平的增加，所标定的Y轴代表在人类GCF中所发现的BG水平的增加，并且该表具有为表示出在高、中等和低危险率意义的标志区域中上面有相应的IgA和BG坐标限定点的标志的表区域。
例Ⅳ下面是本发明的一个用品的另一个有代表性的例子。
用于分析IgA/弹性硬蛋白酶比的分光光度用品包括GCF采集部分20个预裁好的滤纸带。
GCFIgA分析部分20个包括PBST(0.01M磷酸盐缓冲的、pH为7.01的0.15N的NaCl盐水，带0.05%的吐温)的微离心管;50mlPBST冲洗溶液;4个微滴定板;10ml在0.1MpH为9.6的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲剂中稀释成1∶256000的山羊抗人类IgA抗血清;10ml过氧化物酶标志的山羊抗人类IgA，在PBST缓冲剂中稀释为1∶4000;10ml的0.1M包括30mg邻苯二胺与0.3%过氧化氢的柠檬酸盐缓冲溶液;10ml的0.1MHCl溶液，以及一个IgA测定用的标准曲线。
弹性蛋白酶测定部分2ml的TST缓冲溶液(50mM的TrisHCl，pH为7.0，0.15NaCl以及1%的三硝基甲苯X-100;如CoxⅡ中所述)，2个白色塑料盘;40个6mm直径的Whatman3MM纸盘，用一种弹性硬蛋白酶底物(即溶于50mMTrisHCl中的250μM的甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-7-氨基-4-三氟甲基香豆素，pH为9.0，以及350mMNaCl和5%的二甲基甲酰胺并且干燥一整夜)浸渍过;以及1ml溶于1.0N的HCl中的1%的对二甲氨基肉桂醛。
然后将相应样品的产色的颜色反应同含有适当的染料的溶液相对照以得到一系列与所试验的IgA和弹性硬蛋白酶样品同样颜色的溶液，进而得到一系列代表不同浓度的IgA和弹性硬蛋白酶的有色溶液。这个系列溶液就是同对取自危险率待测的患者的GCF样品所做的产色的颜色反应测定所得结果所以比较的颜色强度标准。
确定IgA/弹性硬蛋白酶比的方法包括将由所测定的GCF样品得到的IgA和弹性硬蛋白酶颜色强度与相应的在一个基质台上的颜色标准相对照，所述的基质台的Y轴代表人类GCF中所发现的弹性蛋白酶浓度的增加，并且X轴代表IgA浓度的增加。由坐标所确定的基质台上的点落在一个将在确定为高、中等或低危险的区域中;越靠近Y轴的区域危险率越高。
权利要求
1.一种检测或评价目前或以后患活性牙周炎的危险率的方法，包括a)采集龈缝流体；b)测量龈缝流体中IgA的含量；c)测量龈缝流体中多形核白细胞的标志的含量；d)将从步骤(b)和(c)所得的量的比与一个标准进行比较。
2.如权利要求1所述的方法，其中IgA为总血清形IgA，并且多形核白细胞的标志为β-葡萄糖醛酸酶。
3.如权利要求1所述的方法，其中IgA为总血清形IgA，并且多形核白细胞的标志为弹性硬蛋白酶。
4.一种用于检测或评价目前或以后患活性牙周炎的危险率的用品，包括(a)一个用于测量一个或多个龈缝流体样品中IgA的量的装置;(b)一个用于测量一个或多个龈缝流体样品中多形核白细胞标志的量的装置;以及(e)一个由步骤(a)和(b)的装置所确定的量的比值所进行比较的标准。
5.如权利要求4所述的用品，其中测量多形核白细胞标志的量的装置是一个测量β-葡糖醛酸酶的装置。
6.如权利要求4所述的用品，其中测量多形核白细胞标志的量的装置是一个测量弹性硬蛋白酶的装置。
全文摘要
本发明涉及检测或评价目前或以后患活性牙周炎的危险率的方法和用品，包括(a)采集龈缝流体；(b)测量龈缝流体中IgA的量；(c)测量龈缝流体中多形核白细胞的标志的量；(d)将从步骤(b)和(c)所得的量的比与一个标准进行比较。
文档编号G01N33/68GK1093168SQ9311933
公开日1994年10月5日 申请日期1993年9月18日 优先权日1992年9月18日
发明者R·E·辛格 申请人:普罗格特-甘布尔公司