专利名称：：肺结核快速检验试剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种肺结核快速检验试剂，更确切地说，本发明涉及一种包含已精确确定最低及最高阳性临界值的显示载体的肺结核快速检验试剂。传统的肺结核检验方法包括细菌培养法和痰抹片检查法，前者将痰样品置于LowensteinJensenSlants试管中培养，历时八周才能获得最后结果，检验极为费时；而后者检验灵敏度低。目前最新的肺结核检验方法是血清检验法，例如，R.Maes(ClinWochenschr.1991；69696-709)使用抗原-60，并利用免疫连结酶法来测定血清中抗原-60的抗体并进行定量；BenjaminRG等(Am.Rev.Respir.Dis.1982；1261013-6)使用抗原-5，并利用免疫连结酶法来测定血清中抗原-5的抗体；英国Omega公司利用38KD抗原制成免疫连结酶试剂盒；Kreatech公司利用KP-90抗原制成免疫连结酶试剂盒。虽然免疫连结酶法灵敏度高，但实验耗时至少三小时以上，而且需用仪器判读，不仅成本高，而且具有局限性。为克服现有技术之不足，本发明提供一种肺结核快速检验试剂，该试剂包含一种已精确确定最低及最高阳性临界值的显示载体，用该试剂检验肺结核灵敏度高，且快速省时。本发明的一种肺结核快速检验试剂，其特征在于该试剂包含(I)一种已精确确定最低及最高阳性临界值的显示载体，该显示载体是平均粒径为0.1μm～0.9μm选自塑胶、碳黑、金属、纤维质有颜色的颗粒，在该颗粒表面上固定一种受体或多种受体复合体，该颗粒的空白处固定或占满一种阻断蛋白质，采用连续稀释的已知抗体浓度的液体样品经检测精确确定半定量值；(II)一种已精确确定相对配体浓度的溶液。本发明中所用的显示载体为平均粒径0.376μm和0.5μm的聚乙烯苯颗粒。本发明中所述的受体是一种抗原或半抗原，在显示载体表面上固定一种抗原或多种抗原复合体，例如，抗原-5、抗原-60、38KD抗原等。在显示载体的空白处固定或占满一种阻断蛋白质，例如gelatin、glycerol、TritonX-100、Tween-20或一种血清蛋白质(牛血清蛋白质、兔血清蛋白质等)，优选为牛血清蛋白质。在本发明中，精确确定出显示载体的最低及最高阳性临界值，其意义在于检测出一种精确的半定量值。例如，将已知抗体浓度的液体样品(血清样品)连续稀释成1X，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶8，再将显示载体与每一样品单独反应，3～5分钟后出现肉眼可见的测定指标，从而可确定是否为阳性反应，并确定最高阳性稀释段，例如1∶4阳性。由于显示载体已经精确定出最高及最低阳性临界值，因此，可很容易推算出最高阳性稀释段的半定量值。当然，若想获得更精确的半定量值，可在最高阳性稀释段作进一步稀释后，再与显示载体反应，即可获得最精确的半定量值。本发明中所述的相对配体是一种抗结核杆菌抗体。此相对配体可与显示载体上的多种肺结核杆菌抗原复合体形成结合反应。而上述的液体样品中的被测物也会与显示载体上的一种抗原或多种抗原复合体形成结合反应。因此当相对配体、液体样品和显示载体依顺序同时反应时，此相对配体将与液体样品中的被测物一起竞争去与显示载体上的一种抗原或多种抗原复合体结合，使之成为肉眼可见的测定指标。本发明中，一种已精确确定相对配体浓度的溶液可与液体样品中的被测物一起竞争去与显示载体上的一种抗原或多种抗原复合体结合而形成所谓的竞争法反应，并呈现肉眼可见的直接判读的测定指标。因此，当将欲测样品置于检测元件上，再加入一种已固定有一种抗原或多种抗原复合体，并已确定最高及最低阳性临界值的显示载体，使其混合反应，然后马上加入一种已精确确定相对配体(即抗结核杆菌抗体)浓度的溶液，从而形成所谓的竞争法反应，此时，若欲测样品不存在被测物，如入抗结核杆菌抗体，或被测物低于所确定的最低阳性临界值，则将形成肉眼可见的阴性凝集反应结果；反之，若欲测样品中的被测物高于最低阳性临界值，则形成不凝集的阳性反应结果。由此可见，本发明是利用免疫分析法，利用抗原、抗体间的专一性反应，将抗原或抗体固定在有颜色的显示载体上，通过欲测样品抗体、检测试剂抗体与抗原的竞争性反应进行显示以检测抗结核杆菌抗体，在3～5分钟内即可得到精确的检测结果。本发明的另一种实施方案，即是利用一种或多种配体直接测定肺结核杆菌菌体。将一种或多种配体各固定于第三显示载体及第四显示载体上。因此，本发明的一种肺结核快速检验试剂，其特征还在于该试剂包含(I)一种第三显示载体，在其表面上固定一种或多种配体；(II)一种第四显示载体，在其表面上固定一种或多种配体；该第三显示载体及第四显示载体是平均粒径为0.1μm～0.9μm选自塑胶、碳黑、金属、纤维质有颜色的颗粒，该颗粒空白处固定或占满一种阻断蛋白质，例如gelatin、glycerol、Tri-tonX-100、Tween-20或一种牛血清蛋白质等。上述固定在第三显示载体上的配体为单克隆抗体或多克隆抗体，例如，兔抗结核杆菌抗体。上述固定在第四显示载体上的配体为单克隆抗体，例如一种抗肺结核杆菌单克隆抗体或不同亚型的抗结核杆菌单克隆抗体。当欲测的液体样品经适当处理(例如加入适量Trypsin，使结核杆菌破裂，然后中和)，再置于检测元件上，加入第三和第四显示载体后充分混合，此时若存在有结核杆菌，则第三和第四显示载体将同时与结核杆菌结合形成肉眼可见的阳性凝集反应；反之，若欲测液体样品中不存在结核杆菌菌体，则形成不凝集反应的阴性结果。在本发明中，也可单独使用上述(I)的第三显示载体或上述(II)的第四显示载体与欲检测样品反应，这足以达到预期的测定结果。但同时使用第三显示载体与第四显示载体进行检测，将会提高其灵敏度。附图1为本发明的经连续稀释的血清样品与显示载体反应结果示意图；附图2为本发明的阳、阴性血清与显示载体和相对配体反应结果示意图。下面的实施例仅为了进一步说明本发明，而不是对其加以限制。实施例(一)A.显示载体的制备(A-1)显示载体的前处理将已经用磷覆盖的0.376μm和0.5μm的聚乙烯苯颗粒(Magsphere、PolymerLabs)，分别置于不同漏斗内，每个漏斗连接一真空马达，漏斗底部内有一个膜孔径为0.2μm的过滤膜用来过滤微粒，加入500mL2N盐酸溶液于漏斗内，搅拌2小时以洗掉磷覆盖物，接着用真空马达抽掉2N的盐酸溶液，再加入500mL去离子水于漏斗内搅拌20分钟，再用真空马达抽掉漏斗内的去离子水，重复此步骤直到加入的去离子水的PH值与被真空马达抽掉的去离子水的PH值达到平衡为止。(A-2)洗涤缓冲液的配制取分析纯NaH2PO4·H2O1.56克分析纯Na3PO49.00克加入800mL去离子水，使其完全溶解，用1M氢氧化钠调节PH值为7.8，加入去离子水直至1000mL。(A-3)抗体或抗原缓冲液的配制(a)取分析纯Na2HPO4·12H2O27.6g，置于1000mL的去离子水中，使其完全溶解；(b)取分析纯NaH2PO4·2H2O28.4g，置于1000mL的去离子水中，使其完全溶解；其中，取(a)液30mL与(b)液70mL互相混合，并调节PH值为5.5，可利用0.5N的盐酸或0.5N的氢氧化钠来调节PH值，最后补加去离子水使其为1000mL止。(A-4)抗原溶液的配制将一种或多种肺结核杆菌抗原复合体直接加入(A-3)抗原缓冲液内，使其浓度为0.2mg抗原/ml。(A-5)检验试剂的配制方法1.取10ml(A-4)抗原溶液(0.2mg/ml)放入50ml离心管内；2.加入0.1g(A-1)已经处理洗涤的0.5μm的聚乙烯苯微粒；3.搅拌3小时以使抗原完全被固定于微粒上；4.加入9g牛血清蛋白，并使其充分混合；5.搅拌1小时，以使牛血清蛋白完全占满微粒空白处；6.加入5％甘油，搅拌或振荡30分钟；甘油亦可用较强之Tri-tonX-100或Tween-20代替，使微粒呈完全分散状；7.在4℃以15000转的速度离心30分钟；8.倒掉上清液，保留聚乙烯苯微粒沉淀物；9.加入10mlPH值为5.5的磷酸缓冲液，充分搅拌或通过振荡使聚乙烯苯微粒沉淀物成为微粒悬浮液，并静置10分钟；10.重复第7、第8步骤；11.加入10mlPH值为7.8的磷酸缓冲液，充分搅拌或通过振荡使微粒沉淀，再使微粒呈悬浮状；12.重复第7、第8步骤；13.加入5ml含5％甘油或TritonX-100或Tween-20的磷酸缓冲液，其PH值为5.5，并加入0.01％防腐剂(叠氮化钠)；14.搅拌或振荡30分钟，使微粒沉淀物再形成完全分散的悬浮液；15.保存于4℃。临界值的确定取已知浓度抗原-60抗体的标准血清如下100unit/ml200unit/ml210unit/ml230unit/ml240unit/ml250unit/ml300unit/ml400unit/ml500unit/ml550unit/ml580unit/ml590unit/ml600unit/ml610unit/ml620unit/ml630unit/ml640unit/ml650unit/ml700unit/ml800unit/ml各取50μl不同浓度的标准血清置于检测元件上，再分别加入20μl(A-5)的显示载体悬浮液，并分别涂开来，于3～5分钟判读结果</tables>注(-)为阴性，(±)为弱阳性，(+)为阳性，(++)为中度阳性，(+++)为强度阳性。取一已知抗体浓度(300unit/ml)的血清样品，作1X，1∶1，1∶2，1∶4，1∶8的连续稀释，取每一稀释样品50μl分别置于检测元件的单独反应圈1、2、3、4、5上，再加入20μl的显示载体(A-5)进入每一反应圈并充分混合，于3～5分钟呈现如下结果上表中检测元件的第1反应圈为1X稀释段，呈凝集的阳性反应，第2反应圈为1∶1稀释段，呈不凝集的阴性反应，第3反应圈为1∶2稀释段，呈不凝集阴性反应，第4反应圈为1∶4稀释段，呈不凝集的阴性反应，第5反应圈为1∶8稀释段，呈不凝集的阴性反应(如附图1所示)。结果表明此血清样品为阳性反应，且在1X稀释段呈阳性凝集反应。依照显示载体的最高及最低临界值推算，即可精确确定半定量值。当然在1X段作更进一步的稀释，并与显示载体反应，将获得更精确的半定量值。实施例(二)(B).一种已精确确定相对配体(抗结核杆菌抗体)浓度的溶液的配制取已知浓度10000unit/ml的抗原-60抗体的血清，将其稀释到1000unit/ml的浓度，并加入0.01％的防腐剂(叠氮化钠)，保存于4℃。取已知500unit/ml的阳性血清50μl进入检测元件上的第6反应圈上(如附图2所示)及取50μl的阴性血清到第5反应圈上，再各加入40μl的(A-5)显示载体，充分混合后，马上再加入50μl之(B)1000unit/ml的抗结核杆菌抗体溶液，充分混合后，于3～5分钟后判读结果，第5反应圈呈现阴性的凝集反应，是为阴性的竞争法反应结果，第6反应圈呈现阳性的不凝集反应，是为阳性的竞争法反应结果。此竞争反应阳性临界的高低，可通过调节抗结核杆菌抗体溶液的浓度来达到。实施例(三)(C).第三显示载体的配制(A-6)抗体溶液的配制将抗结核杆菌多克隆抗体直接加入抗体缓冲液内，使其浓度达到0.2mg抗体/ml。(A-7)检验试剂的配制方法1.取10ml(A-6)抗体溶液(0.2mg/ml)放入50ml离心管内；2.加入0.1g(A-1)已经处理洗涤的0.376μm的聚乙烯苯微粒；3.搅拌3小时以使抗体完全被固定于微粒上；4.加入9g的牛血清蛋白，并使其充分混合；5.搅拌1小时，以使牛血清蛋白完全占满微粒空白处；6.加入5％甘油，搅拌或振荡30分钟；甘油亦可用较强的Tri-tonX-100或Tween-20代替，使微粒呈完全分散状；7.在4℃以15000转的速度离心30分钟；8.倒掉上清液，保留聚乙烯苯微粒沉淀物；9.加入10mlPH值为5.5的磷酸缓冲液，充分搅拌或通过振荡使聚乙烯苯微粒沉淀物成为微粒悬浮液，并静置10分钟；10.重复第7、第8步骤；11.加入10mlPH值为7.8的磷酸缓冲液，充分搅拌或通过振荡使微粒沉淀，再使其呈微粒悬浮状；12.重复第7、第8步骤；13.加入5ml含5％甘油或TritonX-100或Tween-20的磷酸缓冲液，其PH值为5.5，并加入0.01％防腐剂(叠氮化钠)；14.搅拌或振荡30分钟，使微粒沉淀物再形成完全分散的悬浮液；15.保存于4℃。(D).第四载体的配制(A-8)抗体溶液的配制将抗结核杆菌单克隆抗体直接加入抗体缓冲液内使其浓度为0.2mg抗体/ml。(A-9)检验试剂的配制方法1.取10ml(A-8)抗体溶液(0.2mg/ml)放入50ml离心管内；2.加入0.1g(A-1)已经处理洗涤的0.5μm的聚乙烯苯微粒；3.搅拌3小时以使抗体完全被固定于微粒上；4.加入9g的牛血清蛋白，并使其充分混合；5.搅拌1小时，以使牛血清蛋白完全占满微粒空白处；6.加入5％甘油，搅拌或振荡30分钟；甘油亦可用较强的Tri-tonX-100或Tween-20代替，使微粒呈完全分散状；7.在4℃以15000转的速度离心30分钟；8.倒掉上清液，保留聚乙烯苯微粒沉淀物；9.加入10mlPH值为5.5的磷酸缓冲液，充分搅拌或通过振荡使聚乙烯苯微粒沉淀物成为微粒悬浮液，并静置10分钟；10.重复第7、第8步骤。11.加入10mlPH值为7.8的磷酸缓冲液，充分搅拌或通过振荡使微粒沉淀，再使微粒呈悬浮状；12.重复第7、第8步骤；13.加入5ml含5％甘油或TritonX-100或Tween-20的磷酸缓冲液，其PH值为5.5，并加入0.01％防腐剂(叠氮化钠)；14.搅拌或振荡30分钟，使微粒沉淀物再形成完全分散的悬浮液；15.保存于4℃。将胸水样品或经液化的痰样品经简单Trypsin消化及中和后，各取50μl以上样品置于检测元件上，再分别加20μl的第三及第四显示载体于每一样品中充分混合，经3～5分钟后，若呈现肉眼可见的凝集反应，则为阳性的结核杆菌抗原反应。若呈现不凝集反应，则为阴性的结核杆菌抗原反应。在本发明中只单独使用一种第三显示载体或单独使用一种第四显示载体，已足以达到测定要求，但为提高灵敏度可同时使用第三显示载体和第四显示载体进行检测。权利要求1.一种肺结核快速检验试剂，其特征在于该试剂包含(I)一种已精确确定最低及最高阳性临界值的显示载体，该显示载体是平均粒径为0.1μm～0.9μm选自塑胶、碳黑、金属、纤维质有颜色的颗粒，在该颗粒表面上固定一种受体或多种受体复合体，该颗粒的空白处固定或占满一种阻断蛋白质，采用连续稀释的已知抗体浓度的液体样品经检测精确确定半定量值；(II)一种已精确确定相对配体浓度的溶液。2.权利要求1所述的肺结核快速检验试剂，其特征在于显示载体是平均粒径为0.376μm和0.5μm的聚乙烯苯颗粒。3.权利要求1所述的肺结核快速检验试剂，其特征在于受体为抗原或半抗原。4.权利要求1所述的肺结核快速检验试剂，其特征在于阻断蛋白质为牛血清蛋白。5.权利要求1所述的肺结核快速检验试剂，其特征在于相对配体为一种抗结核杆菌抗体。6.一种肺结核快速检验试剂，其特征在于该试剂包含(I)一种第三显示载体，在其表面上固定一种或多种配体；(II)一种第四显示载体，在其表面上固定一种或多种配体；该第三显示载体及第四显示载体是平均粒径为0.1μm～0.9μm选自塑胶、碳黑、金属、纤维质有颜色的颗粒，该颗粒空白处固定或占满一种阻断蛋白质。7.权利要求6所述的肺结核快速检验试剂，其特征在于固定在第三显示载体上的配体为单克隆抗体或多克隆抗体。8.权利要求6所述的肺结核快速检验试剂，其特征在于固定在第四显示载体上的配体为单克隆抗体。9.权利要求6所述的肺结核快速检验试剂，其特征在于该试剂只包含(I)第三显示载体或(II)第四显示载体。全文摘要本发明涉及一种肺结核快速检验试剂,其特征在于该试剂包含:(Ⅰ)一种已精确确定最低及最高阳性临界值的显示载体,该显示载体是平均粒径为0.1μm～0.9μm选自塑胶、碳黑、金属、纤维质有颜色的颗粒,在该颗粒表面上固定一种受体或多种受体复合体,用连续稀释的已知抗体浓度的液体样品经检测精确确定半定量值;(Ⅱ)一种已精确确定相对配体浓度的溶液。用该试剂检测抗结核杆菌抗体以检验肺结核灵敏度高,且快速省时。文档编号G01N33/53GK1169536SQ9610670公开日1998年1月7日申请日期1996年6月25日优先权日1996年6月25日发明者刘永详,陈咏仪申请人:刘永详,陈咏仪