专利名称：使用光寻址电位计传感器测量细胞活性的二维传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种二维传感器及使用该传感器测量细胞活性用的测量系统。
人们正在广泛地进行对于神经细胞的医学研究及关于利用神经细胞作为电器件的可能性的研究。当神经细胞被刺激时，就会产生某种电位。首先，由于阴离子透明度的变化，细胞内侧与外侧的阴离子密度发生变化，然后，细胞膜的电位发生变化。因此，测量细胞膜的电位的二维分布，对于观察样品细胞或机体是有用的。测量电位的二维分布提供了一种确定活性部分及活性水平的方法。
本发明人研制出一种作为二维传感器的集成组合电极，不必将玻璃探针或其他刺激探针插入细胞，即可同时在多个点上测量细胞的电位。这种集成组合电极包括许多排成矩阵的微电极，及其利用导电物质在玻璃板上形成的引线图案，在其上可对样品细胞或机体进行培养。这种集成组合电极使以比玻璃电极或其他普通手段更小的间距，对多个点上的电位变化的测量成为可能。另外，这种集成组合电极还使得对在该集成组合电极上培养的样品细胞或机体进行长期观察成为可能。
但是，这种集成组合电极不适合广泛应用，因为测量电极的尺寸和间距都是固定的。换句话说，很难用一个集成组合电极测量不同的样品。事实上，过去是通过调整电极的尺寸及间距，制造不同的集成组合电极，来适应不同的样品。
现介绍一种二维传感器及使用该传感器的测量系统，它通过改进上述集成组合电极，使电极尺寸和间距可变，从而适宜于广泛地用来测量不同样品的细胞活性。
按本发明的二维传感器含有包括由Si、SiO2和Si3N4制成的三层的衬底，在传感器衬底背面Si层表面上通过汽相淀积形成的、用于形成效应电极的薄膜，以及附在传感器正面的Si3N4层上、用来盛样品细胞、培养基和参考电极的栅栏。当光束在该传感器衬底的背面上照射出光斑时，就得到一种信号，该信号对应于由置于所述传感器的栅栏上的细胞的活性引起的光斑处的电位变化。
本发明的测量细胞活性用的二维传感器基于美国MolecularDevice Co.公司研制的光寻址电位计传感器(LAPS)(美国专利4,758,486或4,963,815中解释的光寻址电位计传感器)。如图5所示，光寻址电位计传感器包括半导体硅衬底101、以及其上的氧化物层102和氮化物层103。作为用来测量诸如与LAPS接触的液体的电解液的pH值的pH值传感器，所述LAPS是人所共知的。下面参照图5简要地解释一下用光寻址电位计传感器测量电解液的pH值的原理。
利用稳压电源105将偏置电压加在由电解液、绝缘体和半导体组成的EIS(电解液、绝缘体和半导体)结构上。经某种频率调制的光束照射在EIS结构的背面。于是如图6所示，便有光电流流过。图6I-V曲线随电解液的pH值沿水平轴(即偏压)偏移。因此，在加上预定的偏压的情况下，检测光电流I即可测出pH值。下面来考虑一下I-V曲线随电解液的pH值偏移的原因。
当电压加在EIS结构上时，在半导体与绝缘体之间的界面上，能带发生翘曲。这个能带的翘曲取决于与绝缘体接触的电解液的pH值。在绝缘体层上，形成了硅醇基团(Si-OH)及氨基基团(Si-NH2)，它们的官能团选择性地与氢核(H+)结合，从而，在电解液中的氢核数与结合的氢核数之间维持平衡。因此，如果电解液的pH值发生变化，则绝缘体上的电荷便发生变化；结果，能带的翘曲便发生变化，半导体与绝缘体之间的耗尽层厚度亦发生变化。厚度的这个变化，亦即耗尽层电容的变化引起光电流的变化。光寻址电位计传感器还利用了半导体的光电导特性，使得当光照射时电导率提高。
和光寻址电位计传感器一样，本发明的二维传感器包括含有由Si，SiO2和Si3N4制成的三层的衬底，以及在Si3N4层上用汽相淀积法形成的效应电极薄膜。本发明的传感器还包括承载样品细胞、培养基及参照电极的栅栏。直接测量由放置在栅栏内的细胞的活性产生的电位变化的二维分布。换句话说，本发明的传感器提供直接由与绝缘体层接触的细胞的活性所产生的电位。相反，如前所述，先有技术的利用光寻址电位计传感器的pH值传感器，通过氢核与在绝缘体表面上形成的硅醇基团(Si-OH)及氨基基团(Si-NH2)的结合而在绝缘体的表面上产生电位。
本发明的传感器改变半导体与绝缘体之间的耗尽层的厚度。从而改变耗尽层的电容。另外，被光束照射的光斑上的电导率增大。于是，从效应电极上便获得基本上相当于光斑上电位变化的信号。
本发明的测量细胞活性用的系统包括上述的二维传感器、以光束在二维传感器背面上照射光斑用的光束源、在二维传感器背面上的效应电极与正面栅栏内的参照电极之间提供直流偏置电压用的电源、以及处理在该两电极之间获得的信号用的装置。最好利用激光束光源作为光束源。激光束能够容易地聚焦在小的光斑上，而且，光斑的位置亦能精确控制。该系统最好还包括维持传感器上栅栏内该样品细胞的培养环境用的装置。
在最佳实施例中，该系统还包括以高频驱动激光器，使之发射高频调制的激光束的装置，并且，所述信号处理装置检测在效应电极与参照电极之间流过的光电流的振幅变化。于是，如前所述，以光电流振幅变化的形式检测出由于与绝缘体接触的细胞的活性产生的电位变化而造成半导体与绝缘体之间耗尽层厚度(电容)的变化。
该系统最好还包括使激光束光源发出的激光束在二维传感器背面预定的面积上高速扫描的装置。这样，在多个光斑上的细胞活性基本上是同时测量的。可以不用一个扫描的激光束，而用包括排成矩阵的多个激光元件的激光矩阵。通过用分时的方法驱动多个激光元件，可以进行速度更快的扫描。作为另一方案，该系统可以包括X-Y平台，后者控制二维传感器的水平位置，以改变激光束照射在传感器上的光斑位置。
图1是利用本发明二维传感器的细胞活性测量系统的框图。
图2A和2B表示图1测量系统用的二维传感器的截面图和平面视图。
图3表示涉及图1测量系统的、光电流流入其中的电路的等效电路。
图4A和4B作为一个例子，表示测出的光电流及其振幅的变化。
图5表示利用先有技术光寻址电位计传感器的pH值测量系统。
图6是一个曲线图，表示用图5测量电路测出的光电流对偏置电压的特性曲线，以及该曲线的偏移。
图1表示本发明的测量细胞活性用的测量系统的最佳实施例。该系统具有用来测量细胞活性的二维传感器1，其上放置了样品细胞2及其培养基。包括样品2及培养基的二维传感器1放置在恒温箱3内。
如图2A及2B所示，二维传感器1包括由Si，SiO2及Si3N4构成的三层衬底、在衬底背面(Si面)上用汽相淀积法形成的的作为效应电极金锑合金薄膜、以及在衬底正面(Si3N4面)形成的栅栏，所述栅栏用来盛样品细胞、培养基及参照电极。图2A表示垂直方向上放大的截面图。
例如，传感器衬底的总厚度是200微米；SiO2层的厚度小于50毫微米；Si3N4层的厚度小于100毫微米。Si衬底是N-沟道型，电阻为10欧姆厘米，厚度为200微米，其背面经精心抛光。用蒸镀法在背面形成的金锑薄膜1a变成合金以形成欧姆接触。
在衬底另一面形成的氮化硅层(Si3N4)对细胞或其它组织样品是非入侵性的。因此，它适宜于培养细胞或其它有机样品。附在Si3N4表面上的栅栏1b，用来盛细胞或其他样品，呈圆柱形，用聚碳酸脂制成。四个螺栓附在二维传感器圆周上的四个点上，用来安装铝框。
在图1中，恒温箱部分3具有双壁结构，保证其内部免受外部细菌的感染。温度控制单元4根据温度传感器的输出，控制加热器和风扇单元5，使得恒温箱部分3的样品室3 a保持恒定温度，例如，37±0.5℃。由95％空气和5％CO2组成的混合气体引入样品室。混合气体的管道上装有流量计6和电磁阀7。该系统具有驱动阀门用的驱动电路7a以及控制驱动电路7a的定时器7b。恒温箱部分3、温度控制单元4及其他部分构成培养装置。
该系统包括在传感器栅栏内的参照电极(RE)与传感器背面上的效应电极之间施加偏置电压用的稳压器8。上述两电极之间的电流信号送入运算放大器9，将信号放大，并把它送到作为处理装置的计算机。计算机包括一个16位A/D转换器。
在传感器的栅栏内有一个对应电极(CE)；CE和参照电极(RE)都连接到稳压器8上。CE用来刺激传感器的栅栏中的样品，以测量样品产生的感应电位。为此目的，将脉冲电压加在CE与RE之间。这个刺激电压(脉冲电压)是按照计算机10来的指令由稳压器8产生的。该系统还可以在不加任何刺激电压的情况下，测量自产生的电位。
图1还说明用来把激光束发射到二维传感器背面去的激光束光源11及其驱动器12。由激光束光源11发射的激光束被包括反射镜和透镜(采用倒置的显微镜的目镜)的光学系统聚焦。该光束可以聚焦成直径只有微米数量级的光斑。激光源驱动器1 2包括用于以千赫兹数量级的高频来调制激光束的调制器。
该系统还包括改变激光照射的光斑在传感器背面上的位置的装置；例如，可以采用X-Y平台，在水平方向移动恒温箱3内所装的二维传感器。该X-Y平台可以以1微米的步距改变X-Y平面上照射光斑的位置。
在上述实施例中，二维传感器1的位置可以移动，而激光束的位置却是固定的。但是，最好不移动二维传感器1，而让激光束进行扫描。可以在光学系统中采用X-Y检流计式反射镜来扫描激光束。一个替代的方案是采用由许多布置成矩阵的激光元件的激光器阵列。采用这个办法时，每个激光元件发射与传感器背面垂直的激光束，而激光元件以分时的方法驱动。
如上所述，二维传感器1的激光照射光斑产生空穴与电子对。这样参照电极与效应电极之间的偏压迫使光电流流动。因为在二维传感器的表面上形成有绝缘层(SiO2及Si3N4)，因此直流无法流动，但因如前所述，激光束是以高频调制的，交流却可以流动。若Ci为绝缘层的电容，Cd是半导体与绝缘体之间的耗尽层电容，而ip是高频调制的激光束诱生的光电流，则光电流i可由从等效电路(图3)推导出来的下列方程式给出i＝CixiP/(Ci+Cd)若电位是由于与绝缘层表面接触的细胞的活性的缘故而在绝缘层的表面上产生的，则该电位在半导体和绝缘体之间的界面上造成能带翘曲。结果，半导体与绝缘体之间的耗尽层厚度以及耗尽层的电容Cd发生某种变化。于是，检测出的光电流也如上述方程式描述的那样发生变化。传感器采用N型半导体时，若在绝缘体的表面产生正电位，则光电流随着电容Cd增大而缩小。另一方面，如果产生负电位，则光电流随着电容Cd减小而增大。
下面将说明一个试验例子，其中用上述测量系统检测老鼠大脑切割样品神经细胞的活性。取出两天年龄的SD鼠的大脑；大脑可见区域的一部分切割成5毫米厚的样品。将该样品放在二维传感器的栅栏内培养。为了提高黏性，传感器表面的氮化硅层用聚赖氨酸处理，并且用DF+f作为培养基。′DF′是比例为1∶1的DMEM和Nutrient Mixture(F12培养基)的混合物；′f′是5微克/毫升的胰岛素、100微克/毫升的转铁蛋白、黄体酮20毫微重量克分子浓度(nM)、氢化可的松20nM、腐胺100微重量克分子浓度(μM)、硒20nM和胎牛犊血清5％的混合物。
上述样品从开始培养后第7至10天便自己产生电位。图4A及4B表示用上述测量系统检测出的样品的电活性。图4A表示以48千赫兹数字化后的光电流；图4B表示每10毫秒处理一次图4A所示电流而得的平均值波形。这些图形说明，光电流的振幅在144.8至145.2秒之间的时间间隔内减小。因此，可以假定，神经细胞的活性在绝缘体表面产生了正电位。当激光照射光斑的位置改变时，在样品的其他部分，也观察到光电流振幅减小的这种情况。
如前所述，本发明的二维传感器采用光寻址电位计传感器结构，该结构包括Si，SiO2及Si3N4层，在Si3N4层上的栅栏内可以培养样品。通过用调制的激光束在传感器的背面照射出光斑而在该光斑检测出细胞活性造成的电位变化。因此，光束光斑的大小和位置，即分别对应测量电极的大小与位置。这样，将激光束聚焦，并使激光束相对于传感器运动，则测量电极的大小与位置就很容易改变。
权利要求
1.一种测量细胞活性用的二维传感器，其特征在于传感器包括包括Si层、SiO2层及Si3N4层的传感器衬底，包括在传感器衬底背面Si层上用汽相淀积法形成的薄膜的效应电极；以及在传感器衬底正面Si3N4层上设置的，用来盛样品细胞、培养基及参照电极的栅栏，当光束在传感器衬底背面上照射出光斑时，即从效应电极获得信号，而该信号大体上相当于光束所照射的光斑上电位的变化。
2.测量细胞活性用的测量系统，其特征在于该系统包括二维传感器，它包括包括Si层、SiO2层及Si3N4层的传感器衬底，包括在传感器衬底背面Si层上用汽相淀积法形成的薄膜的效应电极，以及在传感器衬底正面Si3N4层上设置的，用来盛样品细胞、培养基及参照电极的栅栏，用于以用激光束在传感器衬底背面上照射出光斑的激光源，用于在传感器衬底背面上的效应电极与传感器衬底正面上栅栏内的参照电极之间加直流偏压的直流电源，处理在效应电极和参照电极之间的信号用的装置。
3.权利要求1提出的测量系统，其特征在于该系统还包括维持在传感器衬底上设置的栅栏内培养细胞的环境用的装置。
4.权利要求2提出的测量系统，其特征在于该系统还包括用于以高频驱动激光束光源，使激光源发出高频调制的激光束的装置，其中，所述处理装置检测出在效应电极与参照电极之间流动的光电流振幅的变化。
5.权利要求2提出的测量系统，其特征在于该系统还包括用于使由激光束光源发出的激光束在传感器衬底背面预定的面积内扫描的装置。
6.权利要求2提出的测量系统，其特征在于该系统还包括激光器阵列，后者包括多个排列成矩阵的激光元件，每个激光元件发射出与传感器衬底背面垂直的激光束。
7.权利要求2提出的测量系统，其特征在于该系统还包括X-Y平台，后者控制二维传感器的水平位置，以改变激光照射光斑在传感器衬底上的位置。
全文摘要
二维传感器包括Si、SiO
文档编号G01R19/00GK1156825SQ9610820
公开日1997年8月13日 申请日期1996年6月19日 优先权日1995年6月20日
发明者杉原宏和, 竹谷诚, 龟井明仁, 岩崎裕 申请人:松下电器产业株式会社