专利名称：一种检测或预测老年痴呆病的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术领域和疾病基因诊断领域。更具体地，本发明涉及一种通过检测是否存在载脂蛋白Eε4等位基因(APOE*4基因)而检测或预测老年痴呆症的方法，以及用于该方法的试剂盒。
近年来对Alzheimer氏病(即痴呆病的一种)的研究发现，在这些病人的大脑内存在大量异常的老年斑和嗜刚果红血管病变。虽然对这些异常组织结构的生化成分已进行了广泛研究，但它们在导致老年痴呆病中所起的作用却仍然不详。成熟的老年斑是一种复杂的结构，由淀粉样纤维丝的中心核组成，淀粉样纤维丝被营养不良的轴突、轴索末端和树突、小神经蚀质细胞和星形纤维胶质细胞所包围。老年斑淀粉样中心核是一种称为β-淀粉样蛋白(Aβ)的含40-43个氨基酸残基的多肽，周围被血管包围，从而产生嗜刚果红血管病变。通过体内实验发现，β-淀粉样蛋白多肽具有神经毒性[LaFerla et al.Nat.Genet.1995.921-29]，可在Alzheimer氏病、唐氏综合症、荷兰型遗传性脑出血和老年人大脑中发现。β-淀粉样蛋白多肽是由正常的淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein，简称为“APP”)通过裂解产生的。
载脂蛋白E(ApoE)是一种在体内起很重要作用的蛋白，例如它是血浆脂蛋白的组成成分，参与胆固醇代谢，同时还是肝脏合成的极低密度脂蛋白的成分之一。ApoE蛋白主要有三种异型体，分别为ApoE2、ApoE3、ApoE4。这三种异型体是人第19号染色体一个基因位点上三个等位基因中任何两个等位基因的表达产物。存在三种纯合基因型，分别为APOE2/2、APOE3/3、APOE4/4，以及三种杂合基因型，分别为APOE2/3、APOE2/4、APOE3/4。APOE3/3是最常见的基因型。三种ApoE蛋白的氨基酸组成仅有细微的差别对于第112位和第158位氨基酸残基，ApoE3蛋白分别为半胱氨酸和精氨酸；ApoE4蛋白分别为精氨酸和精氨酸；ApoE2蛋白分别为半胱氨酸和半胱氨酸。
研究发现，APOE基因和老年痴呆病存在相关性，这是一个非常了不起的研究成果，其中主要有三方面的证据(1)连锁分析基因定位法发现，第19号染色体的APOE基因区域同老年痴呆紧密关联；(2)脑脊液中ApoE蛋白同β-淀粉样蛋白多肽固定在一起；(3)在老年痴呆病人大脑神经纤维缠结和老年斑中发现了抗ApoE的蛋白。正是这三方面的有力证据，使APOE基因是老年痴呆病的危险因子这一论断得到世界上几乎所有相关实验室的认可。除了和老年痴呆病有关外，APOE基因和老年认知功能减退[Altstiel et al.1997.Lancet 3491451]、冠心病[Moore et al.1997.Clin.Genet.5122-5]、胆结石[Bertomeu et al.1996.Gastroenterology 1111603-10]、糖尿病及动脉粥样硬化[Semenkovich 1997.Diabetes 46327-34]、大肠癌[Kervinen et al.Gastroenterology 1996.1101785-90]等也存在相关性。
进一步的研究表明，老年痴呆病人中APOE*4基因频率显著高于正常老年人。根据这一原理，通过检测到受试人是否含有APOE*4基因，就可辅助诊断病人可能患老年痴呆或告诉阳性受试人应注意预防老年痴呆。
检测是否是APOE*4基因纯合子或杂合子的方法有两类，它们分别在核酸水平上直接地或在蛋白水平上间接地进行检测，因而分别称为直接法和间接法。直接法主要是使用基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增的限制性内切酶法，直接做基因分型；间接法是通过用等电聚焦法分离ApoE蛋白，再用抗ApoE4蛋白的抗血清进行鉴定，从而间接推测受试人的基因型。
用等电聚焦分离法及抗体结合显色反应来间接地进行APOE基因分型是较早的方法。等电聚焦分离法的原理是蛋白质分子的等电点(pI)不同。ApoE2、ApoE3和ApoE4蛋白的等电点分别为5.9、6.0和6.1，所以不同等电点的ApoE蛋白在连续pH梯度的凝胶中的电泳迁移速率不同，因而可以得到有效的分离。分离出蛋白质之后，通过半干电转移法将蛋白质转到固体支持膜上，然后按标准的Western印迹法，分别用特异的抗ApoE蛋白抗体进行结合测定而作出鉴定。等电聚焦-抗体法是较早使用的方法，由于操作复杂、步骤多、价格昂贵而日渐被PCR-限制性内切酶法(PCR-RFLP)(也称为“基于PCR扩增的限制性内切酶法”)所淘汰。
在直接检测受试人体内APOE基因型的直接法中，有其它多种方法可用于替代基于PCR扩增的限制性内切酶法，其中包括例如可被检测的标记寡核苷酸探针杂交法、连接酶链反应、链取代扩增法、逆转录扩增法、自主维持序列复制法、核酸序列扩增法、复制链反应法等。比如，在前述的APOE基因的“可被检测的标记寡核苷酸探针杂交法”检测技术中，可用特异结合到APOE*4基因的一个、一对或两对探针来检测是否含APOE*4基因(即基因型为APOE2/4，APOE3/4和APOE4/4)，而该探针在相同的条件下不会和APOE*2、APOE*3基因(即基因型为APOE2/2，APOE3/3和APOE2/3)结合。类似地，可用特异结合到APOE*2基因的探针来检测是否含APOE*2基因；用特异结合到APOE*3基因的探针来检测是否含APOE*3基因。综合使用这些探针，就可以确定受检测对象或样品中APOE的基因型[Wenham et al.Clin.Chem.1991.37241-244]。然而，标记寡核苷酸探针杂交法有以下缺点成本高，操作条件难以控制。
目前，基于PCR扩增的限制性内切酶法是较为理想的进行APOE基因分型的检测方法。PCR扩增反应可以按常规方法进行。典型的PCR反应包括三个步骤(1)高温热变性，将待检测样品中的模板DNA双链解成单链；(2)退火反应，让一对特异引物分别同模板DNA 5’和3’末端按碱基互补配对原则紧密结合；(3)延伸反应，在热稳定的高温聚合酶的催化作用下，分别将四种游离碱基(A、T、G和C)根据模板的序列按碱基互补配对原则合成两条互补的双链DNA。一般经过30-35个循环，可将长2kb的DNA从原来的1pg扩增到0.5-1μg，[J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯。《分子克隆实验指南》第二版科学出版社1992pp672-681]。通常，这种含量已足够做进一步的分子生物学实验。
通过PCR反应对各种APOE基因型进行扩增之后，可以用特异的探针、限制性内切酶酶切、变性梯度凝胶或现有的其它可行技术来做基因分型。
Wenham等在The Lancet 1991.3371158-1159发表了通过限制性内切酶酶切技术进行APOE基因分型方法。在该方法中，扩增出的PCR产物覆盖了APOE基因中编码第112和158位氨基酸残基的多态性位点，PCR产物长度是227碱基对，扩增后用限制性内切酶CfoI酶切扩增产物，然后用20％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切片段，由于6种APOE基因型酶切产物长度不同，所以可以进行准确的基因分型。
Hixon等人的方法(J.Lipid Res.1990.31545-48)同Wenham等人的方法相差无几，差别仅在于因所用的引物不同而导致扩增出的PCR产物长度不同，Hixon等人的长度为244碱基对。
Hixon等人和Wenham等人的检测方法虽然可以准确地进行APOE基因分型，但是仍存在一些明显缺点，如成本高，耗时长。
因此，本发明的目的是提供一种改进的检测APOE*4基因的方法，该方法的成本更低和/或耗时更短，同时检测精确度维持不变或更高。
本发明的另一目的是提供一种用于检测APOE*4基因的试剂盒。
在本发明的一个方面，提供了一种检测样品中是否存在APOE*4基因的方法，它包括步骤(a)用样品制备PCR反应模板；
(b)用检测APOE*4基因的特异性引物和步骤(a)中模板，在特异性扩增条件下进行PCR扩增；(c)对步骤(b)的PCR扩增产物进行酶切；(d)对步骤(c)的PCR酶切产物进行电泳；(e)根据步骤(d)的电泳结果判断APOE*4基因的存在与否，其中，在制备模板的步骤(a)中，当样品为组织样品时，蛋白酶的用量为30-75μg/ml；当样品为抗凝血或血块样品时，蛋白酶的用量为0-50μg/ml。
在本发明的另一方面，提供了一种检测APOE*4基因的试剂盒，该试剂盒含有制备模板所需的试剂、进行PCR扩增所需的试剂、进行酶切处理所需的试剂，其中，在制备模板所需的试剂中，当样品为组织样品时，用于制备1份样品的蛋白酶(如蛋白酶K)的用量为30-75μg/ml；当样品为抗凝血或血块样品时，用于制备1份样品的蛋白酶(如蛋白酶K)的用量为0-50μg/ml。在一个较佳例子中，用于制备1份样品的蛋白酶(如蛋白酶K)的含量为0μg/ml。
出于本发明目的，在本申请中所使用的科学名称和术语如本领域科技文献所定义的那样，或者如本领域技术人员通常所熟知的那样。
“APOE*4基因”指含有APOEε4的基因或基因组合形式，它包括了APOE4基因为纯合或杂合的形式，具体而言它包括了APOE2/4、APOE3/4和APOE4/4等基因型形式。
“(可用于)检测APOE*4”指该方法或试剂盒能够用于检测待测样品中是否存在APOE*4基因。应理解的，虽然称该方法或试剂盒能够“检测APOE*4”，但是很明显该方法或试剂盒还可用于检测是否存在APOE*2或APOE*3基因。因此，本发明的方法或试剂盒还用于检测待测样品中是否存在APOE*2或APOE*3基因，和/或用于检测出待测样品中APOE的基因型(即可进行APOE基因分型)。
“APOE*4的特异性引物”指这样的引物，它能够利用APOE基因中编码第112和158位氨基酸的多态性位点，从而使扩增APOE*4基因时得到的不同扩增产物不同于扩增APOE*2基因和/或APOE*3基因时所得到的扩增产物。这些APOE*4特异性引物是本领域技术人员所熟知的，其中包括(但并不限于)Wenham引物，Hixon引物等。此外，还可根据已知的APOE基因的编码序列，结合对应于第112和158位氨基酸的核苷酸序列，用已知的常规方法设计出各种引物(即只要使设计出的引物覆盖对应于第112和158位氨基酸的核苷酸多态性位点即可)。设计这类引物是本领域技术人员能够轻易完成的。
“Hixon引物”指在Hixon等人的方法(J.Lipid Res.1990.31545-48)中所公开的引物，即引物15’-TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3’；引物25’-ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC AC-3’“Wenham引物”指在Wenham等人的方法(The Lancet 1991.3371158-1159)中所公开的引物，即引物15’-TCC AAG GAG CTG CAG GCG GCG CA-3’；引物25’-ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC ACT GCC A-3’。
“制备模板所需的试剂”指将检测样本中的基因组DNA提取纯化过程所用的试剂，其中包括例如PBS、裂解缓冲液、蛋白酶(如蛋白酶K)等。
“进行PCR扩增所需的试剂”指将模板中的极微量APOE基因进行PCR扩增反应过程所用的试剂，其中包括例如dNTP、耐高温DNA多聚酶、Mg2+、DMSO(二甲亚砜)、模板DNA、特异性引物、10×缓冲液和灭菌超纯水等。
“进行酶切处理所需的试剂”指将PCR扩增出的APOE基因进行限制性内切酶反应所用的试剂，其中包括例如限制性内切酶CfoI或HhaI和酶切缓冲液等。
为了成功地进行PCR扩增反应，通常认为必须用蛋白酶对样品进行消化，这主要是因为DNA是与许多蛋白质(尤其是组蛋白结合在一起的)，所以有必要将这些蛋白质消化掉，从而释放出DNA。在制备DNA模板时，加入蛋白酶的主要作用是将与DNA结合的蛋白质消化，例如将组蛋白等去掉，从而使模板更易提纯。通常模板制备时(例如用抗凝血为模板时)所用蛋白酶(蛋白酶K)的浓度是至少100μg/ml(J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯。《分子克隆实验指南》第二版科学出版社1992 pp465)。然而，本发明的本发明人意外地发现，在制备PCR模板时减少蛋白酶的用量，或者甚至在不进行蛋白酶处理的情况下，仍然可以获得相同的或较佳的检测结果，简化了检测程序，并降低了检测成本，尤其是制备模板时的成本。本发明正是在这一意外发现的基础上完成的。
此外，本发明人还意外地发现，即使对于脑组织这样含有大量组织蛋白的组织样品而言，也只需要使用少量蛋白酶就可以制备DNA模板了。例如使用30-75μg/ml的蛋白酶K，并且成功地用对组织样品(如脑组织)进行了APOE的基因分型。
在本发明中，可以使用的蛋白酶包括任何可消化蛋白质的酶，它们包括(但并不限于)蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶等。较优选的是蛋白酶K和木瓜蛋白酶，最优选的是蛋白酶K。
在本发明的检测方法中，蛋白酶的用量通常为0-50μg/ml样品，较佳地为0-30μg/ml，更佳地为0-20μg/ml。
蛋白酶的处理时间没有特别限制，只要样品被均相化(homogenize)即可。通常处理时间为50℃孵育至少约4小时，较佳地为50℃孵育6小时，若检测样本未完全消化可50℃孵育过夜。
适用于本发明的样品可以是含有基因的任何组织、体液或血液，通常使用的样品是血液或组织(如脑组织)，但也可以使用在作常规或其他检测时剩下的凝血块(这样，就可以减少对待检测对象多次采血样所带来的痛苦)。
在用样品制备PCR反应模板的步骤(a)中，除了在用蛋白酶(例如蛋白酶K)进行处理方面有所不同之外，其余方面与常规方法相同。
在制备模板之后，就是用APOE*4特异性引物和步骤(a)中制得的模板，进行PCR扩增。进行PCR扩增的条件就是常规的特异性扩增条件。特异性扩增条件通常可以通过较高的退火温度和/或加入适量变性剂(如甲酰胺等)而实现。各种特异性扩增条件都是本领域技术人员已知的，并在各种文献中有记载，如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中。
在本发明的一个实施例中，所用的PCR扩增条件是先92-97℃(较佳地约96℃)预变性5分钟，然后为3-8个(较佳地约5个)小循环每个循环分别由三步组成(1)66-69℃(较佳地约68℃)25-40秒(较佳地约30秒)；(2)71-73℃(较佳地约72℃)1.5-2.5分钟(较佳地约2分钟)；(3)92-97℃(较佳地约96℃)25-40秒(较佳地约30秒)；再进行28-35个(较佳地约32个)主循环每个循环分别由三步组成(1)58-64℃(较佳地61℃)25-40秒(较佳地约30秒)；(2)71-73℃(较佳地约72℃)1.5-2.5分钟(较佳地约2分钟)；(3)92-97℃(较佳地约96℃)25-40秒(较佳地约30秒)。最后71-73℃(较佳地约72℃)延伸5-10分钟。
在PCR反应扩增之后，加入限制性内切酶进行酶切，可供使用的酶可以是PCR-限制性内切酶法(PCR-RFLP)(也称为“基于PCR扩增的限制性内切酶法”)中任何常用的分型酶，只要该内切酶能够识别APOE基因特异性位点，其中包括(但并不仅限于)CfoI、HhaI等。
在酶切之后，就是对酶切产物进行电泳基因分型。这可以采用常规的检测APOE*4基因所用的电泳条件。例如Wenham、Hixon等人的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条件(文献同上)。
在本发明的一个优选例子中，使用的电泳条件是电泳条件为15-18％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，电压150-200伏特，时间为1.5-2.5小时。
与Wenham、Hixon等人的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条件相比，这一电泳条件的优点在于时间短(只需1.5-2.5小时)，并可用国产8-15厘米(较佳地10-14厘米)凝胶电泳装置(设备成本低)即可有效分离。相比之下，Wenham等人用20％非变性聚丙烯酰胺凝胶，100伏特电泳过夜，时间太长；Hixon等人用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用43厘米电泳装置在恒定电流(45毫安)条件下分离，设备要求高，电泳时间也较长(至少3小时)。
在本发明的另一方面，提供了一种检测APOE*4基因的试剂盒，该试剂盒含有制备模板所需的试剂、进行PCR扩增所需的试剂、进行酶切处理所需的试剂，其中，在制备模板所需的试剂中，当样品为组织样品时，用于制备1份样品的蛋白酶(如蛋白酶K)的用量为30-75μg/ml；当样品为抗凝血或血块样品时，用于制备1份样品的蛋白酶(如蛋白酶K)的用量为0-50μg/ml。在一个较佳例子中，用于制备1份样品的蛋白酶(如蛋白酶K)的含量为0μg/ml。
本发明试剂盒可用来检测或预测是否含有患老年痴呆病的高风险遗传因子，其原理在于老年痴呆病人中APOE*4基因频率显著高于正常老年人，所以根据这个原理，如果检测到受试人含APOE*4基因，就可辅助诊断病人可能患老年痴呆或告诉受试人应注意预防老年痴呆。
本发明试剂盒可以用来检测受试人外周血DNA中是否含或不含APOE*4基因(包括纯合子或杂合子)。如果受试人含APOE*4基因(包括纯合子或杂合子)，则受试人含有患老年痴呆病的高风险遗传因子；如果受试人含APOE*4基因纯合子，则他/她患或易患老年痴呆病的可能性比含APOE*4基因杂合子的受试人更高；如果受试人不含APOE*4基因，则他/她患或易患老年痴呆病的可能性将较低。
对于临床上不能确切诊断的老年痴呆病人、有渐进性记忆减退的老年人和有家族性老年痴呆病史的人，比较适合做老年痴呆易感基因的检测。例如用本发明方法和试剂盒所做的研究表明，在上海地区中国人群中含APOE4/4基因型的受试人将比不含APOE*4基因的人患老年痴呆风险高9.4倍(表1)，况且发病年龄早及平均存活期短。
有证据表明若病人含一个或两个APOE4等位基因加上现有临床资料要比仅有临床资料诊断老年痴呆要准确得多[Mayeux R.et al.N.Engl J Med.1998，338506-11]。所以，为了提高临床诊断水平，为病人服务，有必要做有无APOE*4基因的检测。
使用本发明的优化方法和试剂盒，国内一般实验室或临床生化检验室均可方便地做出准确的APOE基因分型。本试剂盒同国内外其他实验室所用的试剂相比，具有以下优点1.模板制备更简便、纯度较高，所用受试者血样更少(仅100μl抗凝血即可)，成本低。
2.可用于没有抗凝血的场合，用临床肝功能检查等剩余凝血块也足够进行APOE基因分型，适合较大规模的普查，况且用凝血块来做APOE基因分型，几乎未见国内外文献报道。
3.较Wenham、Hixon等人用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定时间缩短，4.重现性好。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，比如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1从-20℃保存的经抗凝处理的受试者外周血细胞样本中检测APOE*4基因(a)用样品制备PCR模板分别吸取经葡萄糖-柠檬酸-柠檬酸钠(ACD)抗凝的-20℃保存的100μl外周血样本放入1.5ml尖底离心管，加入500μl PBS(在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2 gKCl、1.44gNa2HPO4、和0.24gKH2PO4，用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，0.1034 MPa高压灭菌20分钟后，保存于室温)，漩涡振荡器剧烈振荡30秒，12,000转/分离心4分钟后弃上清液，加入300μl裂解缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5％SDS)及1μl蛋白酶K(20mg/ml)，剧烈振荡，50℃水浴保温至少3小时(一般可过夜)。加入400μl氯仿，剧烈振荡，12,000转/分离心5分钟后，将上层液体吸到另一尖底离心管；加入1∶1酚-氯仿400μl，剧烈振荡，12,000转/分离心5分钟后，将上层液体吸到另一尖底离心管；加入400μl氯仿，剧烈振荡，12,000转/分离心5分钟后，将上层液体吸到另一尖底离心管；加入-20℃预冷的无水乙醇600μl，轻轻倒置摇动，可见絮状DNA沉淀析出；12,000转/分离心10分钟，倾倒出上清液，沥干，室温放置20分钟或40℃烘干10分钟；加入150μl灭菌水，50℃水浴溶解至少3小时，即可作为PCR反应的模板。
(b)PCR扩增反应在0.5ml的尖底离心管中加入13μl灭菌水、各0.2μl(8pmol/L)Hixon引物(引物15’-TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3’；引物25’-ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC AC-3’)、2.5μl 10×缓冲液、2.5μl二甲基亚砜(DMSO)、2.5μl Mg2+(25mmol/L)、1μl dNTP(200μmol/L)、0.2μl(5单位/μl)DNA耐高温多聚酶和3μl DNA模板，混匀后再加入经灭菌的15μl石蜡油，随后放入DNA扩增仪扩增。PCR扩增反应先96℃预变性5分钟，随后PCR循环反应由两个程序组成①5个小循环68℃退火30秒；72℃延伸2分钟；96℃变性30秒；②32个主循环61℃退火30秒； 72℃延伸2分钟；96℃变性30秒。最后72℃延伸反应10分钟。PCR扩增反应产物一般仅有一条带，产物4℃保存。
(c)限制性内切酶酶切反应取上述PCR产物12μl放人另一尖底离心管，加入5单位CfoI内切酶，37℃酶切过夜。
(d)在酶切产物中加入2.5μl凝胶加样缓冲液(6×缓冲液)，混匀后上样，用15-18％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，[电泳缓冲液组成(每升)10.Sg Tris碱、5.5g硼酸、4ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)]，电压150-200伏特，电泳1.5至2小时，然后将凝胶取出，放入含0.5μg/ml溴乙锭的容器染色8分钟，再放到254nm紫外灯下观测并拍照记录，作为永久保存，根据酶切片段长度不同做出APOE基因分型。
结果，如Hixon文献中得出的结果相同，用本发明实施例1的方法可以准确地对APOE基因进行分型。
实施例2基本按实施例1程序，对从-20℃保存的经抗凝处理的测试者外周血细胞样本进行APOE*4基因检测，不同点在于蛋白酶K的用量改为50μg/ml。
结果，可以准确地对APOE基因进行分型。
实施例3基本按实施例1程序，对从-20℃保存的经抗凝处理的测试者外周血细胞样本进行APOE*4基因检测，不同点在于蛋白酶K的用量改为0μg/ml。
结果，可以准确地对APOE基因进行分型。
实施例4基本按实施例1程序，对从-20℃保存的经抗凝处理的测试者外周血细胞样本进行APOE*4基因检测，不同点在于引物改为Wenham引物。
结果，如Wenham文献中得出的结果相同，可以准确地对APOE基因进行分型。
实施例5基本按实施例1程序，对从-20℃保存的经抗凝处理的测试者外周血细胞样本进行APOE*4基因检测，不同点在于步骤(d)中的电泳条件采用Hixon的电泳条件并且酶切步骤(c)中使用的内切酶是HhaI。
结果，可以准确地对APOE基因进行分型。
对上海地区中国人群，根据实施例1-5进行检测分析所得出的结果如下表1所示。结果表明，APOE*4基因在老年痴呆病人中高度富集，是患老年痴呆病的高风险因子。换言之，APOE*4基因的存在与否与老年痴呆(AD)病有相关性。
表1上海地区老年痴呆(AD)病人和正常对照的APOE基因频率分布表AD病人对照组(n＝200)(n＝163)性别(女/男) 85/78 105/95年龄(岁) 73.5 5.6 72.7±4.9ε2/24 2ε2/312 20ε2/45 1ε3/393 149ε3/437 26ε4/412 2ε2 25(7.7％) 25(6.3％)ε3 235(72.1％)344(86.0％)ε4 66(20.2％)a31(7.7％)aAD病人组和对照组APOE*4频率之比p＝2.4×10-6，df＝2，x2＝25.9；n＝人数.使用的统计软件Epinfo.5.01中文版此外，按实施例1-5的方法，对上海地区中国人群进行的APO4*4基因检测和分型，并研究了血管性痴呆病相关性，所得出的结果如下表2所示。结果首次表明，APOE*4基因的存在与否与老年痴呆(血管性痴呆)病也存在有相关性。表2上海地区老年痴呆(血管性痴呆)病人和正常对照的APOE基因频率分布表血管性痴呆病人对照组(n＝200)(n＝60)性别(女/男)8/52 105/95年龄(岁) 68.3±6.2 72.7±4.9ε2/2 1 2ε2/3 5 20ε2/4 2 1ε3/3 38 149ε3/4 12 26ε4/4 2 2ε29(7.5％) 25(6.3％)ε393(77.5％) 344(86.0％)ε418(15.0％)a31(7.7％)a血管性痴呆病人组和对照组APOE*4频率之比P＝0.046，df＝2，x2＝6.2；n＝人数.使用的统计软件Epinfo.5.01中文版实施例6从老年痴呆病人中经抗凝处理的新鲜外周血细胞中检测APOE*4基因APOE*4基因分型方法同实施例1相同，仅在模板制备过程中略有不同新鲜抗凝外周血细胞可经-20℃冻融半小时，破坏红细胞膜。
结果，可以准确地对APOE基因进行分型。
实施例7从老年痴呆病人中经抗凝处理的新鲜外周血细胞中检测APOE*4基因基本按实施例1程序，经抗凝处理的测试者外周血细胞样本进行APOE*4基因检测，不同点在于新鲜抗凝血不经PBS清洗，直接提取模板DNA。
结果，可以准确地对APOE基因进行分型。
实施例8从未经抗凝处理的测试者外周血细胞(血块)中检测APOE*4基因基本上按实施例1的程序，不同点在于将100mg凝血块用剪刀剪碎或用匀浆器做成匀浆；蛋白酶K用量为40μg/ml。
结果，可以准确地对APOE基因进行分型。
实施例9从未经抗凝处理的测试者外周血细胞(血块)中检测APOE*4基因基本上按实施例8的程序，不同点在于蛋白酶K用量为0μg/ml。
结果，可以准确地对APOE基因进行分型。
实施例10从大脑组织中检测APOE*4基因基本上按实施例8的程序，不同点在于，所用的样品是脑组织块，蛋白酶K用量为75μg/ml。
结果，可以准确地对APOE基因进行分型。
实施例11从大脑组织中检测APOE*4基因基本上按实施例10的程序，不同点在于，所用的样品是脑组织块，蛋白酶K用量为40μg/ml。
结果，可以准确地对APOE基因进行分型。
权利要求
1.一种检测样品中是否存在APOE*4基因的方法，它包括步骤(a)用样品制备PCR反应模板；(b)用检测APOE*4基因的特异性引物和步骤(a)中模板，在特异性扩增条件下进行PCR扩增；(c)对步骤(b)的PCR扩增产物进行酶切；(d)对步骤(c)的PCR酶切产物进行电泳；(e)根据步骤(d)的电泳结果判断APOE*4基因的存在与否，其特征在于，在制备模板的步骤(a)中，当样品为组织样品时，蛋白酶的用量为30-75μg/ml；当样品为抗凝血或血块样品时，蛋白酶的用量为0-50μg/ml。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，电泳条件为15-18％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，电压150-200伏特，时间为1.5-2.5小时。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该非变性聚丙烯酰胺凝胶的长度为8-15厘米。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白酶的用量为0μg/ml。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该蛋白酶选自蛋白酶K或木瓜蛋白酶。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所用的APOE*4基因的特异性引物选自Hixon引物，Wenham引物。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，PCR条件为(a)92-97℃(较佳地约96℃)预变性5分钟；(b)为3-8个小循环每个循环分别由三步组成(1)66-69℃25-40秒；(2)71-73℃1.5-2.5分钟；(3)92-97℃25-40秒；(c)28-35个主循环每个循环分别由三步组成(1)58-64℃25-40秒；(2)71-73℃1.5-2.5分钟；(3)先92-97℃25-40秒；(d)71-73℃延伸5-10分钟。
8.一种检测APOE*4基因的试剂盒，它含有制备模板所需的试剂、进行PCR扩增所需的试剂、进行酶切处理所需的试剂，其特征在于，在制备模板所需的试剂中用于制备1份样品的蛋白酶含量为0-50μg/ml。
9.如权利要求8所述试剂盒，其特征在于，该试剂盒不含有蛋白酶。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，在进行PCR扩增所需的试剂中，所含的引物选自Hixon引物，Wenham引物。
全文摘要
本发明提供了一种诊断和预测老年痴呆病的基因诊断方法和试剂盒,具体地,本发明提供了一种通过检测是否存在载脂蛋白Eε4等位基因(APOE
文档编号G01N33/68GK1257205SQ9812323
公开日2000年6月21日 申请日期1998年12月16日 优先权日1998年12月16日
发明者贺林, 张建刚 申请人:中国科学院上海生命科学研究中心, 中国科学院上海脑研究所