一种检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含 量的方法，以及该方法在评价植物防御反应能力和生长发育能力中的应用。
【背景技术】
[0002] 检测植物激素的方法有很多，如高效液相色谱（HPLC)、气象色谱-质谱联用 (GC-MS)、毛细管电泳法（CE)、酶联免疫法（ELISA)等，其中高效液相色谱法和气象色谱-质 谱联用法虽然可以比较准确的测量植物激素的含量，但对于仪器以及被测量材料的要求较 高，毛细管电泳法也需要对样品进行荧光衍生化处理，不便于一般实验中的测量。相比而 言，酶联免疫（ELISA)法无需昂贵的仪器，操作简便，也可以同时进行多个样品的检测，所 以被用于检测各种植物激素含量的实验中。
[0003] 酶联免疫吸附法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在 固相载体一一聚苯乙烯微孔板表面进行的一种技术。现在已有的酶联免疫法主要用于检测 茉莉酸（Jasmonic，JA)的含量。而检测植物体内具有活性的茉莉素分子一茉莉酸-异亮氨 酸（jasmonoyl-isoleucine，JA_Ile)的方法还没有。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量的方法，以及该方 法在评价植物防御反应能力和/或生长发育能力中的应用。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨 酸含量的方法。
[0006] 本发明所提供的一种检测茉莉酸-异亮氨酸的浓度的方法，可包括如下步骤：通 过酶联免疫吸附法检测待测样品中茉莉酸-异亮氨酸含量；所述酶联免疫吸附法中，以 JAZl蛋白为包被原，以含有COIl蛋白和待测样品的溶液为待测溶液，以抗COIl蛋白的抗体 为一抗。
[0007] 本发明所提供的一种检测茉莉酸-异亮氨酸的浓度的方法，具体可包括下述步 骤：
[0008] (1)取酶标板，以JAZl蛋白为包被原进行包被；
[0009] (2)加入含有COIl蛋白和待测样品（待测样品疑似含有JA-Ile)的溶液；
[0010] (3)加入一抗；所述一抗为抗COIl蛋白的抗体；
[0011] (4)加入酶标二抗；所述二抗为抗一抗的抗体；
[0012] (5)加入显色剂或发光液；
[0013] (6)检测颜色变化或发光强度，得到待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量。
[0014] 上述方法中，所述JAZl蛋白的包被浓度可为15 μ g/ml。
[0015] 上述方法中，所述JAZl蛋白可为al)或bl)或cl):
[0016] al)氨基酸序列是SEQ ID No. 1所示的蛋白质；
[0017] bl)氨基酸序列是SEQ ID No. 5所示的蛋白质；
[0018] cl)将SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残 基的取代和/或缺失和/或添加得到的与JAZl蛋白相关的蛋白质。
[0019] 上述方法中，所述COI1蛋白可为a2)或b2)或c2):
[0020] a2)氨基酸序列是SEQ ID No. 3所示的蛋白质；
[0021] b2)氨基酸序列是SEQ ID No. 6所示的蛋白质；
[0022] c2)将SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残 基的取代和/或缺失和/或添加得到的与COIl蛋白相关的蛋白质。
[0023] 上述方法中，所述抗COIl蛋白的抗体可为以所述COIl蛋白为免疫原得到的抗体。 上述方法中，所述抗COIl蛋白的抗体具体可为以所述COIl蛋白为免疫原免疫SPF Balb/c 雌性小鼠得到的抗体，对应的酶标二抗可为Abmart公司的Goat Anti-Mouse IgG-HRP。
[0024] 上述方法中，所述抗COIl蛋白的抗体还可为Abiocode公司的COIl (C2)抗体，对 应的酶标二抗可为Abiocode公司的anti-Rabbit 〇
[0025] 本发明还提供了试剂盒。
[0026] 所述试剂盒可包括JAZl蛋白、COIl蛋白和抗COIl蛋白抗体。
[0027] 所述试剂盒可包括包被JAZl蛋白的酶标板、COIl蛋白和抗COIl蛋白的抗体。
[0028] 上述任一所述试剂盒还可包括茉莉酸-异亮氨酸标准品。
[0029] 上述任一所述试剂盒还可包括酶标二抗，如Abmart公司的Goat Anti-Mouse IgG-HRP 或 Abiocode 公司的 anti-Rabbit〇
[0030] 上述任一所述试剂盒中，所述包被JAZl蛋白的酶标板中所述JAZl蛋白的包被浓 度可为15 μ g/ml。
[0031] 上述任一所述试剂盒中，所述JAZl蛋白可为al)或bl)或cl):
[0032] al)氨基酸序列是SEQ ID No. 1所示的蛋白质；
[0033] bl)氨基酸序列是SEQ ID No. 5所示的蛋白质；
[0034] cl)将SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残 基的取代和/或缺失和/或添加得到的与JAZl蛋白相关的蛋白质。
[0035] 上述任一所述试剂盒中，所述COIl蛋白可为a2)或b2)或c2):
[0036] a2)氨基酸序列是SEQ ID No. 3所示的蛋白质；
[0037] b2)氨基酸序列是SEQ ID No. 6所示的蛋白质；
[0038] c2)将SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残 基的取代和/或缺失和/或添加得到的与COIl蛋白相关的蛋白质。
[0039] 上述任一所述试剂盒中，所述抗COIl蛋白的抗体可为以所述COIl蛋白为免疫原 得到的抗体。上述任一所述试剂盒中，所述抗COI1蛋白的抗体具体可为以所述COI1蛋白 为免疫原免疫SPF Balb/c雌性小鼠得到的抗体，对应的酶标二抗可为Abmart公司的Goat Anti-Mouse IgG-HRP0
[0040] 上述任一所述试剂盒中，所述抗COI1蛋白的抗体还可为Abiocode公司的 COIl (C2)抗体，对应的酶标二抗可为Abiocode公司的anti-Rabbit。
[0041] 上述任一所述检测茉莉酸-异亮氨酸的浓度的方法、上述任一所述试剂盒在评价 植物防御反应能力和/或生长发育能力中的应用也属于本发明的保护范围。
[0042] 上述任一所述植物可为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体可为十字 花科植物；所述十字花科植物可为拟南芥。
[0043] 实验证明，利用本发明所提供的一种检测茉莉酸-异亮氨酸的浓度的方法可检测 待测样品中茉莉酸-异亮氨酸的含量，而且特异性强，灵敏度高，对茉莉酸-异亮氨酸的浓 度的最小检测限为1〇ηΜ。利用本发明所提供的一种检测茉莉酸-异亮氨酸的浓度的方法在 评价植物防御反应能力和/或生长发育能力中具有重要的应用。
【附图说明】
[0044] 图1为JAZl蛋白包被浓度确定实验。
[0045] 图2为检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量的方法检测JA-Ile的特异性。
[0046] 图3为检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量的方法检测JA-Ile的灵敏度。
[0047] 图4为检测植物提取物中JA-Ile的含量。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0049] 本实施例中的定量实验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。
[0050] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0051 ] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0052] 下述实施例中的微孔板为Perkin Elmer公司产品，货号为6005290 ;IAA为Sigma 公司产品，货号为12886 ;茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate)和茉莉酸（（±)_Jasmonic acid)为Sigma公司产品，货号分别为392707和J2500,在下文中分别简称MeJA和JA ; 酶标二抗（Goat Anti-Mouse IgG-HRP)为Abmart公司产品，货号为M21001，在下文中简 称Anti-Mouse ;SuperECL Plus超敏发光液为北京普利莱基因技术有限公司产品，产品货 号为ρΙΟΙΟ ;成像仪为Proteinsimple公司产品；酶标仪为Perkin Elme公司产品；质粒 pET28a(+)为Novagen公司产品；Ni-NTA重力柱为Qiagen公司产品，货号为30210 ;大肠杆 菌BL21 (DE3)为全式金公司产品，货号为CD701-03。
[0053] 下述实施例中的野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana) (Columbia-0亚型）（Kim H, Hyun Y, Park J, Park M, Kim M, Kim Η, Lee Μ, Moon J, Lee I, Kim J. A genetic link between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsis thaliana. Nature Genetics. 2004, 36:167-171)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只 为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。拟南芥（Arabidopsis thaliana) (Columbia-0亚型）在下文中简称野生型拟南芥。
[0054] 下述实施例中的茉莉酸-异亮氨酸为实验室合成，茉莉酸-异亮氨酸的分子式见 式1，茉莉酸-