专利名称：用于在液体样品中检查和/或检测生物分子和/或活性物质的方法和测试系统的制作方法
描述本发明涉及一种检查和/或检测至少一种待检查的样品物质的类型和/或数量的方法，其中(a)已提供了加载了探针分子或检测分子的预先配量的数量的载体颗粒，(b)这些负载的载体颗粒以干燥的形式存在，(c)(i)将载体颗粒与含有待检查或待检测的样品物质的液体接触，其中样品物质用一种和/或多种指定的标记参数进行标记，或者(ii)将载体颗粒与存在于同一或不同液体中的样品物质和标记物质或报道物质同时或依次接触，和(d)在一个或多个其间用于接触的样品物质与探针分子或检测分子和标记物质或报道物质能够结合的反应时间之后，分析至少一种(但优选两种或更多种)标记参数，从中可以推断出待检查或待检测的样品物质的数量。
在DE 33 22 373 C2和EP 0 126 450中描述了一种方法，其能够同时测定来自一个样品的多种抗原和/或抗体。将用不同的抗体和/或抗原涂覆的颗粒的混合物与含有待检查或待检测的抗原或抗体的液体混合。在一个其间待检测的抗原或抗体与载体上涂覆的抗体或抗原结合的指定反应时间之后，通过添加具有荧光标记的抗体和/或抗原的液体来鉴定结合的抗原或抗体，该荧光标记的抗体和/或抗原与待检测或待检查的抗原或抗体能够进行种类特异性反应。单个载体的标记的分析借助于特别为颗粒测量而调整的流式细胞测量仪来进行。从该分析中可以推断出待检查的抗原或抗体的性质或存在。通过适当地选择加载在所使用的载体上的抗体或抗原，可以检查待检查的液体或其内含物的预先确定的、所希望的特性。根据将要在待检查的液体中检测或分析哪些抗原或抗体，可以使用加载有相应的抗体或抗原的测试颗粒。
在本文中，将待检查或待检测的生物分子或活性物质称为“样品物质”。在此，术语“生物分子”表示所有这样的分子和分子片段，即其能够自然地以有活力和无活力的性质存在，并且能够通过分离方法或同样的复制而提供，特别是位于或来自植物和动物细胞、器官和生物体中的分子，位于/来自原核生物、位于/来自真菌、位于/来自病毒和噬菌体的分子，还有诸如病毒体、朊病毒及其类似物或者其部分(例如抗原、抗体、DNA、DNA片段等)的分子。
术语“活性物质”在此表示所有由人设计和合成的分子(例如合成的药物)。
用“探针分子和检测分子”来描述用于加载或涂覆载体颗粒的这样的生物分子和/或活性物质，即它们存在于这些载体分子上。
用“标记物质或报道物质”来描述具有已知的、指定的标记参数的这样的生物分子和/或活性物质，利用它们来进行分析，即用于计算。特别是可以考虑这样的生物分子或活性物质作为这种标记物质或报道物质，即这些生物分子或活性物质本身具有荧光活性、磷光活性、生物发光活性、化学发光活性、生色团活性、放射活性或酶活性，或者它们与具有一种或多种所述活性的分子偶联。
现有技术中已知的方法包括下列步骤-在反应容器中配制颗粒混合物，所述颗粒涂覆有作为探针分子或检测分子的第二种抗体/抗原，-添加含有待检查或待检测的第一种抗原/抗体作为样品物质的液体，-温育，-在反应时间结束之后洗涤载体颗粒以去除未结合的物质和分子，-添加具有经荧光标记的第三种抗体和/或抗原作为标记物质或报道物质的液体，所述的抗体和/或抗原可与待检测或待检查的第一种抗原/抗体(即样品物质)种类特异性地反应。
-温育，-洗涤以去除未结合的物质和分子，和-借助于特别为载体颗粒测量而调整的流式细胞测量仪来分析单个载体颗粒的标记。
在分析方法开始之前，在反应容器中配制用所希望的作为探针分子或检测分子的生物分子/活性物质涂覆的载体颗粒或载体颗粒混合物。这一移液步骤完全决定性地影响着检查结果的质量，因为由此确定了存在于颗粒上的探针分子或检测分子在测试溶液中的浓度。存在于颗粒上的生物分子/活性物质在测试溶液中的浓度影响着测试校准和测试水平，由此影响着所检查的样品材料的评价。偏离测试校准的颗粒数目也会例如在于流式细胞测量仪中进行分析时影响计数速率。
如果提供例如处于含水缓冲溶液(例如PBS)中的待配制的载体颗粒，则由于较高的载体颗粒浓度(例如对于由聚苯乙烯制成的载体颗粒为1.05g/ml)而会导致沉降过程。因此在再次使用之前，必须进行悬浮液的均质化，其中必须小心翼翼地避免悬浮液起泡沫和气泡的形成。在接着的工艺步骤中，必须注意避免载体颗粒的再次沉淀。
本发明的任务为如此进一步开发已知的方法，即避免所述的缺点和可能在保持高灵敏度和特异性的同时施行简化的操作方法。
用具有文端所述的性质的方法解决了这一任务，其特征在于，加载了探针分子或检测分子的载体颗粒在大小和/或颜色方面是不同的，和在步骤(d)中还分析载体颗粒的大小和/或颜色。
“在颜色方面不同”在本文中表示，将或可以将载体颗粒不仅用不同的颜色种类或染料(例如红色、绿色、蓝色)，而且用同一颜色种类/同一染料的不同颜色强度(例如从亮红色至暗红色的10个强度等级)着色(编号)。因此，在进行颜色分析时要分析颜色种类和/或颜色强度。
在本发明的方法中，预先配量地以干燥形式提供加载或涂覆有探针分子或检测分子的载体颗粒。如此，实验室合作者能够追溯至经涂覆的载体颗粒的预配量的数量，而无须首先在费事的移液步骤中准确地确定载体颗粒的数量。所以，在检查或检测样品物质时不再需要这一特别关键且误差密集的步骤，和该方法因此还可在简化的条件下无需大量专门技术地实施。准确确定载体颗粒的数量的步骤事先在制备相应的测试系统时施行。
因为预配量的数量的载体颗粒以经干燥的，优选经冻干的形式提供，所以此外还延长了涂覆载体颗粒的探针分子或检测分子的耐久性。
提供冻干形式的载体颗粒是可以特别简单地实现的，并且是精确的。
本发明的方法不仅可用于检查某一存在的样品物质(即生物分子或活性物质的类型)的数量，而且可用于检测究竟是否含有某一样品物质(即相应的生物分子或活性物质)。
在一个优选的实施变化形式中，为此使用这样的载体颗粒，即其不只是在颜色和/或大小不同，而是此外还用不同的探针分子或检测分子加载。
对于这一目的，预配量的数量的并在其上存在有探针分子或检测分子的载体颗粒特别可以由多个组别的载体颗粒组成，其中各个的组别首先通过所属载体颗粒的大小和/或着色(颜色种类和/或颜色强度)，其次通过存在于载体颗粒上的探针分子或检测分子的类型而相互区分。换句话说就是每种单个组别的载体分子具有同样的大小和颜色种类/颜色强度，并用同样的探针分子或检测分子进行加载，而两个组别的载体分子区别于其大小和/或其颜色种类和/或颜色强度，并且用不同的探针分子或检测分子进行加载。
采用本发明方法的这一实施变化形式，能够以最简单的方式和方法在一次单一检查过程中于同一个测试液体中检测或检查不同的样品物质。
在此可以使用与样品物质和/或与标记物质或报道物质互补的探针分子或检测分子。在此，将这样的探针分子或检测分子(即生物分子或活性物质)称为是互补的，即它们通过亲和或杂交反应和/或共价反应而结合其他样品物质(生物分子和/或活性物质)。
为了检验在液体样品中究竟是否含有某一类型的样品分子(即生物分子或活性物质)，优选使用(可能会)与任选待检测的样品物质反应的探针分子或检测分子的载体颗粒。
本发明的方法还可以通过利用竞争性反应来实施。在此，样品物质和探针分子或检测分子是非常类似的甚至是相同的，和标记物质和报道物质与样品物质和/或探针分子或检测分子是互补的。在竞争性反应中，样品物质和探针分子或检测分子竞争着与经标记的、互补的标记物质或报道物质结合。如果在溶液中不合有样品物质微粒，则所有的标记物质或报道物质微粒与探针分子/检测分子结合，由此也就结合在载体颗粒上，并可探测到。另一方面，如果存在许多样品物质微粒，则所有的标记物质或报道物质微粒与样品物质微粒结合，而不与探针分子/检测分子结合，因此也就不会结合在载体颗粒上，由此就无法探测到。
在有利的本发明方法的设计中，以压制品的形式提供预配量的并经干燥或冻干的载体颗粒。换句话说就是使用含有经干燥或冻干的载体颗粒的以预配量的形式的压制品。该压制品容易操作，并能够在任何反应容器中使用。
该方法变化形式的进一步形成预先规定，使用不同组别的压制品，这些压制品的不同点是在其中含有的载体颗粒用不同的探针分子或检测分子加载，其中每个单独的压制品的载体颗粒加载有同样的探针分子或检测分子。
例如，对于在妊娠期间的感染血清学测试(所谓的“妊娠期调查(Schwangerschaftspanel)”)可以提供一种单一压制品，其含有不同大小和/或不同颜色的载体颗粒，这些载体颗粒加载有对于风疹、弓形体病、CMV、HSV、VZV、细小病毒组等的抗原和/或抗体而使用的探针分子或检测分子，其中每种载体颗粒种类加载有一种确定的探针分子或检测分子种类。
同样也是很好的是，例如对于用于疫苗接种控制的感染血清学测试可以提供一组多种压制品，其中每种压制品只含有一种单一的确定类别的载体颗粒，这些载体颗粒用一种确定的类型的探针分子或检测分子加载，例如对于破伤风、白喉、百日咳等的抗原和/或抗体而使用的探针分子或检测分子。然后将这些单独的压制品分别根据所提出的问题混合在一起。
预配量的、经干燥或冻干的载体颗粒可以同样良好地在反应容器如微量滴定板或小管中以非压缩的形式提供，这些反应容器然后可以直接用于分析待检查的液体而无需其他附加的措施。试验员只是必须在该反应容器中注满待检查的液体，以便将这些液体与预配量的、因此已知的数量的冻干载体颗粒接触，而不再需要转注过程或数量测定。
作为对于液体中的样品物质的指定标记参数，建议使用荧光染料，因而在本发明方法的步骤d)中利用荧光进行分析。
特别有利的是，通过如下方法能够简化本发明的方法，即将预配量的、用探针分子或检测分子加载的载体颗粒与预配量的数量的标记物质或报道物质一起以经干燥的或经冻干的形式提供。在此，标记物质或报道物质具有与待检查的或待检测的样品物质种类特异性地反应这样的特性。它们可以由一种或多种成分组成，和它们可以具有一种或多种与探针分子或检测分子和/或样品物质互补的结构。
在其中已经用预配量的载体颗粒提供了经标记的标记物质或报道物质这样的方法中，通过精简另一个配制步骤来保证误差率的减少。另外，通过减少方法步骤的数目来简化程序，因为与上述的现有技术的方法步骤相反，在本发明方法的这一变化形式中只是需要添加任选含有待检查或待检测的样品物质的液体，和例如借助于特别为颗粒测量而调整的流式细胞测量仪来分析单个载体颗粒的标记。
本发明的目标还为在本发明的检查和/或检测方法中使用的测试系统(试剂盒)，其特征在于，该测试系统包含在大小和/或颜色(颜色种类和/或颜色强度)方面属于不同的类别的、加载有探针分子/检测分子的载体颗粒，这些载体颗粒以经干燥的形式存在。
在颜色方面的载体颗粒的编号优选地以已知方式通过下列方法来完成，即通过将一种或多种荧光团可能以不同的浓度引入载体颗粒中，或者通过将一种或多种相同类型或不同类型的荧光性纳米颗粒附着在载体颗粒表面上。
试验员可以直接使用这一本发明的测试系统(试剂盒)而无需移液或配制步骤，从而以所述方式减少了主要的误差来源。这种测试系统(试剂盒)可以事先大量制备，并如此例如进行销售。
载体颗粒在该测试系统(试剂盒)中优选地以经冻干的形式存在。
该测试系统可以包含在大小和/或颜色方面属于不同的组别的载体颗粒，其中同组的载体颗粒用相同类型的探针分子或检测分子加载，和不同组别的载体颗粒载有不同的探针分子或检测分子。
经干燥或经冻干的载体颗粒或者预先配量地以一种或多种压制品的形式存在于测试系统中，或者预先配量地以未压缩的形式存在于反应容器中。
在本发明的测试系统的一个实施变化形式中预先规定，另外还包含至少一种可以与待检查的样品物质种类特异性地反应的标记物质或报道物质。这种标记物质或报道物质特别地可以具有荧光活性、磷光活性、生物发光活性、化学发光活性、生色团活性、放射活性或酶活性所述标记物质或报道物质优选地一起或者包含在压制品中，或者包含在用载体颗粒填充的反应容器中，并可以由一种或多种成分组成。
对于测试系统(试剂盒)的这些特殊的实施方案，上面对于本发明的方法已经描述的优点也存在于类似的方法中。
所有本发明的测试系统(试剂盒)优选地在靠近中心的位置进行制备并从那里进行销售，从而它们在实验室购买之后可以无需附加的配制或移液步骤而直接用于所希望的检查。
本发明的方法和本发明的测试系统将在下面借助于附图和实施例作更详细的解释。在此不言而喻，在实施例中所描述的施行方式在相关的检查中遵循还适用于就其中存在的样品物质而进行每种其他的液体样品检查的原则。
图1示例性地(自然也可考虑其他的温度和压力特性曲线)显示了在实施用于本发明测试系统(试剂盒)的本发明制备方法过程中于冻干时的温度或压力过程。
实施例1在孕妇中的感染血清学检查-变化形式1为了获得关于某一(某些)样品物质例如风疹、弓形体病、CMV、HSV、VZV、细小病毒等的抗原和/或抗体在孕妇的血清样品中存在和/或性质的信息，将大小不同的载体颗粒用不同的探针分子或检测分子，即用于这些抗原和/或抗体以及可能还有其他抗原和/或抗体的探针分子或检测分子，进行加载，预先配量，冻干，和或者以处于反应容器中的未压缩的形式提供，或者以压缩成压制品的形式提供。
为了分析这一血清样品，实验室合作者动用具有预配量的数量的载体颗粒的这种反应容器或这种压制品。实验室合作者知道其使用了多少载体颗粒，因此知道使用了多少探针分子或检测分子，以及知道这些探针分子或检测分子对于哪些待检查或者可能待检测的样品物质是特异的。实验室合作者将该压制品或者该在反应容器中的未压缩形式的载体颗粒与含有样品物质的待检查的液体，即与血清样品在一个或上述反应容器中接触。同时或顺次向其中添加一定数量的标记物质或报道物质。
如果标记物质或报道物质已经与加载有探针分子或检测分子的载体颗粒一起以经干燥的形式、预配量的形式以及或者压缩成压制品或者未压缩地装入反应容器中的形式存在，那么这一步骤可以省略。
在反应时间结束之后，在载体颗粒上结合不同的样品物质和相同类型的标记物质或报道物质。
通过分析载体颗粒的大小(例如在为颗粒测量而调整的流式细胞测量仪中)可以推断出类型，和通过分析样品物质和/或标记物质或报道物质的指定标记参数可以推断出待检查液体中的样品物质的数量。
为了去除未结合的物质，可以在各个反应时间结束时施行本身已知的洗涤步骤。
实施例2在孕妇中的感染血清学检查-变化形式2与实施例1一样，但是不使用不同大小的载体颗粒，而是使用不同颜色的，即在颜色种类和/或颜色强度方面不同的载体颗粒，并用不同的探针分子或检测分子加载。
通过分析不同的颜色或颜色强度，可检测不同的载体颗粒，因此可检测在载体颗粒上结合的探针分子或检测分子的类型(种类)以及由此探测的样品物质的类型(种类)，和通过分析样品物质和/或标记物质或报道物质的指定的标记参数可以推断出待检查液体中的样品物质的数量。
实施例3在孕妇中的感染血清学检查-变化形式3与实施例2一样，但是使用大小不同且颜色不同的载体颗粒，其中颜色的差异性可以位于不同的颜色种类或不同的颜色强度(在颜色种类相同时)方面。同样大小和颜色种类或颜色强度即同样编号的载体颗粒用相同类型(种类)的探针分子或检测分子加载，具有其他大小和/或颜色种类和/或颜色强度即具有其他编号的载体颗粒用其他类型(种类)的探针分子或检测分子加载。
通过分析不同的大小和/或颜色种类和/或颜色强度，可检测不同的载体颗粒，因此可检测在载体颗粒上结合的探针分子或检测分子的类型以及由此探测的样品物质的类型，和通过分析样品物质和/或标记物质或报道物质的指定的标记参数可以推断出待检查液体中的样品物质的数量。
实施例4不使用标记物质或报道物质的样品物质的检测为了检测核酸序列(例如DNA)可以已经将样品物质例如某一DNA进行荧光标记。对于这样的测试，首先要扩增出待检测的DNA。这一步骤可以用已经荧光标记的引物来进行，以致于待检测的DNA(也就是样品物质)的扩增物已含有荧光团。
在于大小和颜色(颜色种类和/或颜色强度)方面经编号的载体颗粒上偶联探针分子或检测分子，例如以一种第二(互补的)DNA的形态。待检测的DNA(样品物质)的经荧光标记的扩增物直接与该位于载体颗粒之上的(第二)探针-DNA或检测剂-DNA结合。
不需要使用标记物质或报道物质。因此，为了实施该方法建议使用实施例5的测试系统。
另一方面，也存在这样的可能性，即使用标记的和非标记的第三种DNA分子作为标记物质或报道物质，其在样品-DNA和探针-DNA或检测剂-DNA之间起着桥接的作用。为了实施这一方法变化形式，合适的是实施例6的测试系统，即以经干燥的、预配量的形式包含加载有探针-DNA或检测剂-DNA的载体颗粒以及标记或非标记的标记-DNA或报道-DNA的测试系统。
实施例5本发明的测试系统(试剂盒)的制备和组成-变化形式1以指定的数量和在准确监测的条件下，在反应容器中配制一种或多种类型的载体颗粒(即具有同一编号或具有不同编号的载体颗粒)，其中优选使用一种特殊的缓冲剂-稳定剂体系(例如50mM的磷酸缓冲液、150mM的氯化钠、0.02％的叠氮化钠、8g/L的明胶水解产物，pH7.4，另外还有成骨架剂和助剂如蔗糖、苯丙氨酸)。如果需要，可借助于超声波和/或机械搅拌使载体颗粒均质化。随后将此预配量的载体颗粒通过冻干或其他干燥方法进行干燥，因此载体颗粒变得具有耐久性和可更简单地进行操作。在此，优选采用从图1中获知的温度和压力特性曲线。根据该测试系统将用于何种分析，使用或者(a)同一编号的并只加载有一种类型(种类)的探针分子或检测分子的载体颗粒，或者(b)同一编号的但加载有不同类型(不同种类)的探针分子或检测分子的载体颗粒，或者(c)不同编号的并在编号前只加载有一种类型(种类)的探针分子或检测分子的载体颗粒。
在干燥/冻干之后，可以将这种加载有探针分子或检测分子的载体颗粒形成为压制品，其中这些压制品各含有预定数量的载体颗粒。
在这样的压制品的情况下，即其只含有一种类型的具有确定的大小和确定的颜色种类和/或颜色强度的载体颗粒，也就是只含有同一编号的载体颗粒，并且其中该载体颗粒只加载有一种类型(种类)的互补的探针分子或检测分子，载体颗粒的混合物可以通过在反应容器中组合相应的压制品而分别制备。
实施例6本发明的测试系统(试剂盒)的制备和组成-变化形式2与实施例5一样，但是将加载有探针分子或检测分子的载体颗粒与指定数量的标记物质或报道物质一起在使用特殊的缓冲剂-稳定剂体系的情况下和在准确监测的条件下于反应容器中进行配制，通过冻干或其他干燥方法进行干燥，和最后以压缩成压制品的形式或者未压缩地装入反应容器中的形式提供。
权利要求
1.检查和/或检测至少一种样品物质的类型和/或数量的方法，其中(a)提供加载有探针分子或检测分子的预配量的数量的载体颗粒，(b)这些负载的载体颗粒以干燥的形式存在，(c)(i)将载体颗粒与含有待检查或待检测的样品物质的液体接触，其中样品物质用一种和/或多种指定的标记参数进行了标记，或者(ii)将载体颗粒与存在于同一或不同液体中的样品物质和标记物质或报道物质同时或依次接触，和(d)在一个或多个其间用于互相接触的样品物质与探针分子或检测分子和标记物质或报道物质能够结合的反应时间之后，分析至少一种标记参数，从中可以推断出样品物质的类型和/或数量，其特征在于，加载有探针分子或检测分子的载体颗粒在大小和/或颜色(颜色种类和/或颜色强度)方面不同，和在步骤(d)还分析载体颗粒的大小和/或颜色。
2.权利要求1的方法，其特征在于，将载体颗粒冻干。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于，在颜色和/或大小方面不同的载体颗粒用不同的探针分子或检测分子进行加载。
4.权利要求1-3中任一项的方法，在该方法中经干燥或经冻干的载体颗粒以压制品的形式提供。
5.权利要求3和4的方法，在该方法中使用不同类别的压制品，所述压制品的不同点是在其中含有的载体颗粒用不同的探针分子或检测分子加载，其中每种单独的压制品的载体颗粒加载有同样的探针分子或检测分子。
6.权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于，经干燥或经冻干的载体颗粒在反应容器中以预先配量的形式提供。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于，样品物质的指定的标记参数为荧光染料，和在步骤d)中利用荧光进行分析。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于，标记物质或报道物质具有荧光活性、磷光活性、生物发光活性、化学发光活性、生色团活性、放射活性或酶活性。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其特征在于，将预配量的、加载有探针分子或检测分子的载体颗粒与预先配量的数量的标记物质或报道物质一起以经干燥或经冻干的形式提供，所述标记物质或报道物质适合于与待检查或待检测的样品物质进行种类特异性的反应。
10.在权利要求1的方法中使用的测试系统，其特征在于，该测试系统包含在大小和/或颜色方面属于不同的类别的、加载有探针分子或检测分子的载体颗粒，所述载体颗粒以经干燥的形式预配量地提供。
11.权利要求10的测试系统，其特征在于，同一类别的载体颗粒用相同类型的探针分子或检测分子加载，和不同类别的载体颗粒载有不同的探针分子或检测分子。
12.权利要求10或11的测试系统，其特征在于，载体颗粒以冻干的形式存在。
13.权利要求10-12中任一项的测试系统，其特征在于，经干燥的载体颗粒预配量地以一种或多种压制品的形式存在。
14.权利要求10-12中任一项的测试系统，其特征在于，经干燥的载体颗粒预配量地存在于反应容器中。
15.权利要求10-14中任一项的测试系统，其特征在于，该测试系统另外还包含至少一种标记物质或报道物质。
16.权利要求15的测试系统，其特征在于，标记物质或报道物质具有荧光活性、磷光活性、生物发光活性、化学发光活性、生色团活性、放射活性或酶活性。
全文摘要
用于检查和/或检测至少一种样品物质的类型和/或数量的方法，其具有如下特征提供预配量的数量的在大小和/或颜色(颜色种类和/或颜色强度)方面不同的、加载了探针分子/检测分子的且经干燥的载体颗粒。或者(i)将这些载体颗粒与含有待检查或待检测的样品物质的液体接触，其中样品物质以一种和/或多种指定的标记参数进行了标记，或者(ii)将它们与存在于同一或不同液体中的样品物质和标记/报道物质同时或依次接触。在一个或多个反应时间之后，分析载体颗粒的大小和/或颜色，以及样品物质和/或标记/报道物质的至少一种标记参数，从中可以推断出样品物质的类型和/或数量。测试系统，其特征在于，该测试系统包含在大小和/或颜色方面属于不同的类别的、加载了探针分子/或检测分子的载体颗粒，这些载体颗粒预先配量地以干燥的形式存在。
文档编号G01N33/58GK1756958SQ200480005779
公开日2006年4月5日 申请日期2004年5月21日 优先权日2003年5月26日
发明者G·赫尔曼, I·屈尔曼－拉本斯, U·朔贝尔 申请人:维润赛润研发有限公司