专利名称：检测脑炎或脑疾发病风险的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测(确定)脑炎或脑疾发病风险的方法，一种测试某种药物是否涉及诱导脑炎或脑疾风险的方法，和一种筛选用于治疗脑炎或脑疾的候选药物的方法。
背景技术：
近年来，关于因流感病毒感染而导致或引起的脑炎或脑疾的报道正在增加。这种脑炎或脑疾是一种疾病，其主要症状包括迅速表现出意识混乱和痉挛，特别是通常致命的脑水肿的迅速表现。由于其引发的高死亡率和其后遗症的高发病率，脑炎和脑疾已成为一个社会问题。
少儿流感经常伴随中枢神经系统的症状，诸如意识混乱、热痉挛、长时间的痉挛和呕吐，在某些病例中，发展迅速而且可能导致死亡。在一些这样的病人中，脑疾会跟随服用解热剂如阿司匹林TM(乙酰水杨酸)或双氯酚酸钠，而且在这样的情况下，疾病称作雷氏症候群。在涉及流感病毒的感染，但原因不明的其他情况下，在日本曾用流感脑炎/脑疾的专门术语。这种流感脑炎/脑疾的发病病理学和机理未知，而且还没有一个清楚的疾病的定义。流感脑炎/脑疾与上述的雷氏症候群或急性坏死性的脑疾(ANE)之间的区别并不显著。(参见TakehiroTogashi，“流感脑炎和脑疾(Infuenzal encephalitis andencephalopathy)”，Nippon Rinsho(Japanese Journal of Clinical Medicine)，Vol.58，No.11，第87-92，2002)；和Tsuneo Morishima，“流感脑炎和脑疾病理学和策略(Influenzal encephalitis and encephalopathyPathology and strategy)”，Sogo Rinsho(Clinic All-Around)，Vol.49，No.2，第300-305页，2000)。
已知在日本经常发现患有先天性脂肪酸代谢紊乱，特别是CPT II(肉毒碱棕榈酰转移酶II)不足或是GA2(戊二酸尿2型)的婴儿，和在欧洲和美洲经常发现患有MCAD(中链酰基辅酶A脱氢酶)不足的婴儿中，脑疾自身表现为没有流感感染的类似雷氏症候群的病症(参见Tamoki，Y.等人，“自1985年至2000年检测的患有线粒体脂肪酸β-氧化和相关紊乱的日本病人的调查(A survey of Japanesepatients with mitochondrial fatty acid β-oxidation and related disordersas detected from 1985 to 2000”，Brain & Developmet，24(2002)675-680)。
在这些病例中(雷氏症候群，流感脑炎/脑疾，先天性脂肪酸代谢紊乱的类似雷氏症候群病症，等)，脑水肿和大脑功能紊乱的发病机理甚至到今天还不知道，而且在目前的状况下，仍然还没有建立起用于精确的鉴别诊断、治疗和预防这些疾病的方法。本领域真的需要上述诊断方法等等被建立起来。
本发明人已经揭示过在流感病毒感染中作为病毒增殖循环必要因素的小型纤溶酶的出现(参见Murakami，M.，等人，“在细支气管的上皮细胞中发现的小型纤溶酶通过广谱流感病毒A和仙台病毒引发感染(Mini-plasmin found in the epithelial cells of bronchioles triggersinfection by broad-spectrum influenza A viruses and sendai virus.)”Eur.J.Biochem.268(10)，2847-2855，2001)。
上述小型纤溶酶已知是一种血脑屏障的干扰因子(参见Nagy，Z.等人，“通过纤溶酶干扰血脑屏障的完整性(Perturbation of integrity ofthe blood-brain barrier by fibrolytic enzymes)”，Blood Coagulation &Fibrinolysis，9(6)，471-478，1998)。
在流感感染-诱导的脑炎/脑疾中，小型纤溶酶扰乱血脑屏障并迅速引发脑水肿。在一些例子中，它在脑血管的内皮细胞中进一步诱导病毒的复制。此外还发现在与血脑屏障紊乱和病毒复制一致的位点上小型纤溶酶水平升高(参见Hiroshi Kido等人，“生物蛋白酶和抑制剂抑制流感病毒的传染性和加重感染(Biogenic proteases and inhibitorsinhibiting the infectivity of influenza viruses and the aggravation of theinfections)”，Molecular Medicine，Vol.39，No.1，第48-53页，2002)。
与雷氏症候群相连，也从脂肪酸β-氧化抑制的观点上作出了一篇报道(参见Trauner，D.A.，等人，“通过流感病毒B和唾液酸在小鼠中抑制脂肪酸β氧化牵连雷氏症候群(Inhibition of fatty acid betaoxidation by influenza B virus and salicylic acid in miceImplications forReye’s syndrome)”，Neurology，38，239-241，1988)。
发明内容
本发明的第一个目的是揭示流感脑炎/脑疾的病理学、发病因素和/或发病机理。更特别地，本发明的第一个目的是阐明不同类型的脑炎/脑疾，包括流感脑炎/脑疾以及迄今还不能与流感脑炎/脑疾区分的雷氏症候群的发病因素和/或发病机理。
本发明的第二个目的是建立一种用于精确诊断，治疗和预防尤其是脑炎/脑疾的方法。
本发明的第三个目的是提供一种检测(确定)脑炎/脑疾发病和发病风险的方法。
本发明的第四个目的是提供一种确定任何不同药物如解热药和止痛药是否涉及引发脑炎/脑疾发病的风险的方法，也就是一种检测任何不同药物对于脑炎/脑疾的发病是安全的方法。
本发明的第五个目的是提供一种筛选治疗脑炎/脑疾的候选药物的方法。
本发明的进一步的目的是提供不同的试剂以进行上述的各种方法。
本发明人所做的深入研究旨在阐明流感脑炎/脑疾的发病因素，发病敏感因素和/或发病机理。在研究过程中发现在流感脑炎/脑疾的模型鼠的大脑中，小型纤溶酶在受炎症影响的器官中产生，例如受肺炎影响的肺部中，通过血液在大脑血管内皮聚集，结果是它自毁血脑屏障或进一步使得病毒在血管内皮细胞中复制。
连续研究的结果是，本发明人发现在流感脑炎/脑疾模型鼠的大脑中，定位在大脑血管内皮细胞膜或线粒体外膜上的通道蛋白VDAC(电压依赖的阴离子通道)起小型纤溶酶，纤溶酶或纤酶溶原受体的作用，上述VDAC的表达水平的升高导致了血管上皮的小型纤溶酶，纤溶酶和纤酶溶原水平的升高，据此，VDAC是导致脑炎/脑疾发病的直接因素。
更特别地，本发明人揭示出当VDAC的表达或其编码基因水平升高时，产生对脑水肿高度敏感的状况，而且，当例如流感病毒感染或某些其它炎症例如，附加作为触发因素时，诱使血脑屏障的通透性增加和脑水肿加重，神经机能也出现了障碍，导致脑炎/脑疾的发病。如此揭示的脑炎/脑疾发病的机理更详述如下。
那么，上述的对脑水肿高度敏感的状况是由下面不同因素或其它未知的因素诱导的。这些因素是例如通过(1)流感病毒感染，或其它病毒感染，例如RS病毒感染，腺病毒感染，麻疹病毒感染，脊髓灰质炎病毒感染或疟疾感染，(2)服用解热剂，如阿司匹林，双氯酚酸钠或甲酚钠酸，(3)例如由先天代谢紊乱导致的线粒体中长链和中链脂肪酸的代谢紊乱，或(4)由于药物或人工透析诱发的、血液卡胺酸(Cartinine)水平降低引起的线粒体中脂肪酸代谢的紊乱。在这种对脑水肿高度敏感的状况下，VDAC的表达也在一个高水平上。当这种状况处于VDAC表达水平升高是伴随着诸如流感病毒等病原体的感染时，通过体内各种炎性反应，VDAC的表达更会加速，或者促进小型纤溶酶或纤溶酶的产生，以及小型纤溶酶或纤溶酶会在大脑血管内皮聚集。脑炎/脑疾由此就自身表现出来。
如上所述，在VDAC表达水平的升高是直接导致脑炎/脑疾的因素这一新的发现的基础上，进一步研究的结果而完成了本发明。
本发明提供了由下面1-11项定义的方法和药剂。
第1项.一种检测脑炎/脑疾的方法，包括制备获自疑似脑炎/脑疾发病的病人的含VDAC样品，测定样品中VDAC表达水平，并利用所述表达水平的升高作为指标来检测脑炎/脑疾的发病和发病的敏感度(发病风险)。
第2项.如第1项所定义的方法，其中的脑炎/脑疾是流感脑炎/脑疾。
第3项.如第1或2项所定义的方法，其中VDAC表达水平的测定是以测定VDAC基因转录的方式进行的。
第4项.如第1或2项所定义的方法，其中VDAC表达水平的测定是以测定VDAC蛋白的方式进行的。
第5项.如第1-4项所定义的方法，其中的VDAC含有至少一种选自VDAC-1，VDAC-2和VDAC-3中的同工型。
第6项.一种确定由药物导致的脑炎/脑疾发病风险的方法，包括在所述药物存在的系统中，测定表达VDAC的细胞中VDAC的表达水平，与在无所述药物存在的系统中测定的表达VDAC的细胞中VDAC表达水平相比较，以及利用两者表达水平之间的差异作为指标来确定由药物导致的脑炎/脑疾的发病风险。
第7项.第6项所定义的确定由药物导致的发病风险的方法，其中在药物存在下表达VDAC的细胞系统是通过施用药物给测试动物而形成的。
第8项.第6项所定义的确定的药物导致的发病风险的方法，其中药物存在的表达VDAC的细胞系统是通过向表达VDAC细胞的培养液中添加药物而形成的。
第9项.一种筛选用于治疗脑炎/脑疾的候选药物的方法，包括在测试物质存在的系统中测定表达VDAC的细胞中VDAC的表达水平，将如此测定的表达水平与在测试物质不存在的系统中测得的表达VDAC的细胞中VDAC的表达水平相比较，后者的水平作为参照值，并且与参照值相比，当测试物质对降低表达水平有效时挑选其作为候选药物。
第10项.一种筛选能够抑制小型纤溶酶，纤溶酶或纤酶溶原与作为受体的VDAC结合的候选药物的方法，该方法包括在测试物质存在的系统中测定小型纤溶酶，纤溶酶或纤酶溶原与VDAC蛋白的结合水平，将如此测定的结合水平与所述测试物质不存在的系统中小型纤溶酶，纤溶酶或纤酶溶原与VDAC蛋白的结合水平相比较，后者的水平作为参考值，并且参考值相比，当测试物质对降低结合水平有效时，挑选其作为候选药物。
第11项.一种用于治疗脑炎/脑疾的药剂，即一种用于抑制与VDAC蛋白结合的小型纤溶酶和纤溶酶的产生从而抑制脑炎/脑疾的发病的药剂，如通过第9或第10项定义的方法来挑选。
说明书中缩写的氨基酸、肽、核苷酸序列、核苷酸等等的表示符合IUPAC-IUB“IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature，Eur.J.Biochem.，1399(1984)”或“核苷酸序列和/或氨基酸序列的专利说明书等撰写指南(Guideline for drafting patent specifications and soforth relative to nucleotide sequences and/or amino acid sequences)”(由Japanese Patent Office编辑)推荐的规则以及符合相关技术领域中代码或符号的使用的常规。
说明书中使用的术语“VDAC”笼统地包含了在其含义范围内的VDAC的同工型，即VDAC-1，-2和-3，或VDAC基因和VDAC蛋白等等，在它们之间没有做任何区分。VDAC本身是已知的，例如人源VDAC-1，-2和-3的核酸序列可以由国家生物技术信息中心(NCBI)提供的信息而获得，编号分别是“NM003374”，“NM003375”和“NM005662”。用在后面所描述的实例部分中的脑炎模型鼠的鼠源VDAC-1，-2和-3的核苷酸序列也可采取同样的方式获取，编号分别是“NM011694”，“NM011695”和“NM011696”。
说明书中使用的术语“流感脑炎/脑疾”指的是由流感病毒感染引起的且涉及发热、痉挛和早期意识混乱，在某些情况下伴随脑水肿和CT显示两侧丘脑损伤的疾病。所述流感脑炎/脑疾包括所有伴随流感传染并显示出VDAC表达水平升高作为发病因素的脑炎/脑疾的类型。在某些情况下，所述流感脑炎/脑疾也包括诸如迄今为止定义为雷氏征候群、急性坏死性脑疾和HSES(出血性休克和脑疾综合症)等疾病。此外，不符合上面提到的那些脑炎/脑疾、但是伴随流感传染且作为发病机理的VDAC表达水平升高的这样的脑炎/脑疾类型也包括在其中。
这里提到的“脑炎/脑疾”不但包括上面提及的流感脑炎/脑疾，而且也包括不同类型的、观察到VDAC表达水平升高作为发病因素的脑炎/脑疾。因此，当观察到VDAC表达水平升高作为发病因素时，无关其起因，那些迄今已经归为雷氏症候群等等类型的脑炎/脑疾甚至都可包括在这里所定义的脑炎/脑疾中。
根据本发明，可以阐明不同类型的脑炎/脑疾，典型的是流感脑炎/脑疾的发病因素和/或发病机理，可建立用于精确诊断、治疗和预防尤其是这样的脑炎/脑疾的方法。根据本发明，也有可能提供一种确定由药物导致的脑炎/脑疾发病风险的方法(测试药物的方法)，一种筛选用于治疗脑炎/脑疾的候选药物的方法，以及用于实施这些方法的各种试剂。
附图简要说明
图1是WT和JVS小鼠的大脑、肺、肝脏和血液中流感病毒基因组拷贝数的PCR测定结果的比较表示法。
图2是纤酶溶原、小型纤溶酶和微纤溶酶与VDAC结合水平测定结果的表示法。
图3是RT-PCR分析揭示的由不同诱导发病因素，典型的是由流感传染引起的WT小鼠大脑中VDAC-1表达水平升高结果的表示法。
图4是WT小鼠的大脑和肺部中VDAC-1 mRNA表达水平的实时PCR测定结果的图形比较表示法。
图5是WT小鼠的大脑和肺部中VDAC-2 mRNA表达水平的实时PCR测定结果的图形比较表示法。
图6是WT小鼠的大脑和肺部中VDAC-3 mRNA表达水平的实时PCR测定结果的图形比较表示法。
图7为免疫组织化学分析获得的显微照片，显示了JVS小鼠的大脑中VDAC蛋白的表达。
图8为免疫组织化学分析获得的显微照片，显示了流感传染的JVS小鼠的大脑中VDAC蛋白的表达。
实施本发明的最佳方法下面将一一详述依据本发明的脑炎/脑疾的诊断方法，药物安全性的确定方法以及候选药物的筛选方法。
(1)确定(诊断)脑炎/脑疾的方法在实现本发明的方法时，首先要制备获自疑似脑炎/脑疾发病的病人的含有VDAC的样品。提供的样品不受特别的限制，它含有VDAC基因的转录本或翻译产物(VDAC蛋白)，是检测的目标。用于转录分析的样品的实例是不同的由外周血、淋巴结、脑脊髓液、胸腔液体、腹腔液体、手术时得到的洗涤物等等中获得的含有组织细胞和切除组织的生物样品，或者象头发这样的组织的细胞。用于翻译产物分析的样品的实例除了上述提到的同样的组织细胞外，还有得自其中的体液。这些样品用传统的方法收集或制备。
样品中VDAC表达水平的测定既可以以测定样品中VDAC基因表达水平(转录测定)的方式，以可以以测定VDAC基因的表达产物，VDAC蛋白的表达水平(翻译产物的测定)的方式进行。不论哪种方式，都可通过本领域通常已知的各种方法来进行。要测定的VDAC可以是任何同工型VDAC-1，-2和-3或者可以是至少两种或更多种的混合物。
更特别地，可通过测定VDAC基因的转录物mRNA来确定VDAC基因的表达水平，如通过RT-PCR(反转录聚合酶链式反应；E.S.Kawasaki，等人，RNA扩增。在“PCR方案，方法和应用指南”中(Amplification of RNA.In PCR Protocols，A Guide to Methods andApplications)，Academic Press，Inc.，San Diego，21-27(1991))的RNA扩增，利用像RNA印迹这种技术的细胞水平测定的方法(分子克隆(Molecular Cloning)，Cold Spring Harbor Lab.(1989))，原位RT-PCR(Nucl.Acids Res.，21，3159-3166(1991))，或原位杂交，或通过NASBA(基于核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification)，Nature，350，91-92(1991))。
更佳的检测方法是以RT-PCR为基础的检测方法。可根据实时PCR法(参见，例如Proc.Natl.Acad Sci.，88，7276-7280(1991))；日本未审专利公开号No.H06-500021；Biotechniques，22，176-181(1997))较方便地进行，该方法可对想要的PCR扩增产物进行实时检测。
更特别地，可以通过下面的方式进行RT-PCR。即，用传统的方法从样品中提取RNA，由RNA制备cDNA，以此为模板设计能够扩增VDAC基因区，即目标的一对引物(正向链与上述cDNA的(-链)结合，而反向链与(+链)结合)与模板杂交。然后，用传统的方法进行PCR并检测扩增的双链DNA。该扩增的双链DNA可以用实时PCR技术或其他的方法进行检测，如方法中包括进行上述PCR时，使用预先用放射性同位素或荧光物质标记的引物，再检测因此产生的标记的双链DNA，或者方法中包括将生成的双链DNA例如用传统的方法转移到尼龙膜上，再用标记的探针检测杂交产物。
上述方法中使用的引物仅需要能够特异性扩增想要的VDAC即可，而且可在本领域已知的VDAC DNA序列信息的基础上以适当的方式进行设计。一般建议每个引物的核苷酸的长度大约是10-35，较佳地是大约15-30。同样地，设计的探针只要能够特异地与PCR扩增产物杂交且能够特异检测扩增产物即可。探针可以与引物的核苷酸长度大致相同，而且可以被标记，例如用任意的报告荧光染料和任意的猝灭荧光染料标记，从而可用在依照实时PCR技术的检测中。
这些引物和探针可用自动化DNA合成仪，例如DNA synthesizerPharmacia LKB Gene Assembler Plus(Pharmacia出品)按照传统的方法来合成。
进行RT-PCR或实时PCR的仪器、设备和多用试剂盒都是商用的，而且根据本发明进行这些测定时，这些商业产品都可适当采用。
上述可利用的各种步骤，如RNA的提取、DNA或DNA片段的合成、用于裂解、删除、添加或连接的酶处理、RNA或DNA的分离、纯化、复制、筛选和扩增都可用传统的方法进行(参照，例如，Bunshi-Idengaku Jikkenho(分子遗传学实验(Experiments in MolecularGenetics))，1983年由Kyoritsu Shuppan Co.，Ltd出版；PCR Technology，1990年由Takara Shuzo Co.，Ltd.出版)。也可以根据其应用进行适当的调整。更进一步地，例如在对扩增产物的碱基序列进行测定时，本领域已知的各种方法或将来有可能开发的方法都可被广泛地采用(例如，循环测序参见，如Shohei Hattori，“利用PCR直接确定碱基序列(Direct base Sequence determination Usiug PCR)，”Jikken Igaku(实验医学)(专利)新PCR技术和应用(New PCR Techniques andApplicarions，29-35(1997))，Published by Yodosha)。
VDAC蛋白表达水平的检测可根据比如像蛋白印迹或利用如VDAC蛋白抗体的ELISA这些传统的方法来进行。更特别地，例如蛋白印迹可以通过抗VDAC蛋白的抗体作为第一抗体，然后用放射性同位素如125I或荧光物质标记的标记抗体(标记抗体能与第一抗体结合)作为第二抗体，利用放射探测仪(例如BAS-1800IIproduct of Fuji PhotoFilm Co.)或荧光探测仪检测和测量发自被标记的结合产物的放射性同位素或荧光物质的信号。
VDAC蛋白的生理活性，也就是上述的测量目标是已知的，而且蛋白的量与其活性之间确实有一定的关联。因此，根据本发明的检测(诊断)也可以通过测定蛋白的活性代替测定蛋白水平来进行。这样，本发明也包括一种诊断脑炎/脑疾的方法，含有通过任何已知方法测定并评价作为指标的VDAC蛋白活性。
依照本发明的诊断方法，当VDAC表达水平(VDAC基因表达水平，VDAC蛋白水平或VDAC活性，在这里统称为“VDAC表达水平)用上面描述的方法测定为升高时，可断定为有脑炎/脑疾发病或发病风险。例如，可通过预先测定从正常受试者获得的样品中VDAC的表达水平，确定平均值或统计学中间值，用该值作为用于比较的参照值，或通过时间间隔对每个病人进行多次测定，用在先的测定值作为参照值与在后的测定值比较来判断这种升高。
VDAC蛋白的抗体可以利用VDAC蛋白作为免疫原来制备VDAC蛋白的抗体。抗体包括抗血清(多克隆抗体)和单克隆抗体。抗体的制备本身是本领域技术人员非常熟悉的。VDAC蛋白的抗体也可以通过传统的方法来制备(参见，例如，Zoku Seikagaku Jikken Koza(生化实验讲座(Lectureson Biochemical Experiments)，second series)“Men-eki SeikagakuKenkyuho(免疫生化方法(Methods in Immunobiochemistry))”，由Japanese Biochemical Society编辑))。利用由此得到的抗体可有益于，例如，纯化VDAC蛋白，或通过免疫学技术分析或识别该蛋白。VDAC蛋白的抗体可部分地用来销售，而且这些商业产品也可在本发明的实践中适当地使用。
例如，通过基于抗体的免疫学方法测定VDAC表达水平的一个特殊的实例在后面的实例部分说明。那么该抗体有利于在药用领域作为检测VDAC表达水平的试剂，或用作诊断涉及VDAC的脑炎/脑疾的试剂。进一步地，如后面所描述的，抗体也可被用来筛选能够抑制VDAC活性的候选药物。
用于脑炎/脑疾的诊断试剂或试剂盒(探测试剂或试剂盒)适用于本发明的脑炎/脑疾诊断方法。该试剂盒包含适用于进行上述VDAC表达水平测定方法的试剂作为活性成分。
该试剂盒含有作为基本成分的适用于检测VDAC表达水平的方法的特异试剂。根据所用的检测方法可适当地选择这种特异试剂。该试剂中尤其包括抗VDAC蛋白的抗体，用于检测VDAC基因转录的探针和/或用于检测的引物对等等。因此，该试剂被表征为用于本发明中特异检测测定目标物的方法所必需的试剂。用于进行PCR的通用试剂不考虑作为该诊断试剂盒的必需成分，但是例如像用于杂交的试剂可以包含在该诊断试剂盒中。因此本发明也提供了用于诊断脑炎/脑疾的这种试剂盒。
(2)由药物导致的脑炎/脑疾发病风险的确定方法(药物测试法)本发明也提供了一种测试已知的或新的用于治疗流感传染的药物例如对一旦服用是否导致引发脑炎/脑疾的风险的方法，或者一种评估这种风险水平的方法，换句话说，一种测试药物对脑炎/脑疾发病的安全性(安全性测试)的方法。
该药物测试的方法是在药物存在的系统中测定表达VDAC的细胞的VDAC表达水平，并与在药物不存在的系统中测定的表达VDAC的细胞的VDAC表达水平相比较，以所述表达水平的差别(变化)为指标。如果在药物存在的系统中表达VDAC的细胞的VDAC表达水平与在药物不存在的系统中测得的表达水平相比至少显示没有升高(也就是说差别是零或负数)，那么可以断定该测试药物不会有引发脑炎/脑疾的风险。
上述药物存在的系统包括(a)通过给试验动物施用药物而形成的系统(体内系统)和(b)在表达VDAC的细胞的培养液中添加药物而形成的系统(体外系统)。
试验动物不是特别限制的，但可以优选利用处于线粒体应激(mitochondrial stress)状况下的模型动物。这种模型动物表现出升高的VDAC表达水平且处于脑炎/脑疾(脑水肿)发病的预备期(升高的脑水肿敏感阶段)，而且当诸如流感病毒的感染这样的触发因素作用于该模型动物时，它自身会表现出严重的水肿(流感脑炎/脑疾发病模型)，所以这些动物适合用于上面提到的药物测试。
通过诱导线粒体内膜上的长链脂肪酸代谢紊乱可以制成处于线粒体应激之下的模型动物。可被提到的作为典型的模型动物的范例例如是肉毒碱转运蛋白OCTN2-缺陷小鼠(例如JVS(幼态内脏皮脂腺病)小鼠)和用肉毒碱拮抗物(例如β-(2，2，2-三甲基肼)-丙酸盐；THP)给药的小鼠。
用测试的药物给药这些测试动物，并测定该动物的不同组织和/或细胞，特别是脑组织中VDAC的表达水平。一旦观察到表达水平(参照是由省略施用测试药物得到的无药物系统中的表达水平)有所升高(当差别是正值时)，可以断定测试药物具有脑炎/脑疾的发病风险。当表达水平没有可疑的的升高或表达水平有所下降时，可以断定该测试药物是安全的，即没有脑炎/脑疾的发病风险。
根据本发明，可以利用一种通过将测试药物添加到表达VDAC细胞的培养液中而建立的系统来进行药物的测试。在这个系统中可利用的表达VDAC的细胞是那些获自不同的带有VDAC或其基因的组织或细胞的细胞，因此，可以使用的细胞例如是脑细胞，肺部细胞，肝脏细胞或现成的细胞株。表达VDAC的细胞可以是人工的重组细胞，由传统的方法引入VDAC基因使之表达VDAC。表达VDAC的细胞进一步包括那些获自处于上面提到的线粒体应激状况下的模型动物的细胞。
用在本发明测试方法中的细胞也包括是细胞聚集体的组织，例如脑组织，肺部组织和肝脏组织。
这些细胞可维持在普通的细胞培养基中，并且细胞中VDAC的表达水平可以用传统的方法在培养基中预先含有一定量的测试药物或不含测试药物的情况下来测定。在传统的程序中含测试药物的系统与不含药物的系统的条件(温度、pH、培养基组成等)是相同的，而且要从这些条件中进行适当选择，在这些条件下细胞不会死亡而VDAC可以表达。在上述测试方法中，可以通过(1)所描述的不同方法来测定VDAC的表达水平。
(3)筛选用于脑炎/脑疾治疗的候选药物的方法本发明进一步提供一种用于候选药物筛选的方法，包括测定在含有测试物质的系统中表达VDAC的细胞的VDAC表达水平，将测定到的表达水平与不含所述测试物质的系统中的表达VDAC的细胞的VDAC表达水平(该水平作为参照值)相比较，当与参照值相比测试物质产生起降低VDAC表达水平的作用时(具有VDAC表达水平降低的活性)，挑选其作为候选药物。
上述筛选方法中可用作含测试物质的系统和不含测试物质的系统与(2)所描述的体内和体外的含药物和不含药物的系统是同一种。用测试物质处理(给测试动物施用和添加到细胞培养液中)和VDAC表达水平的测定也是用同样的方法进行。被筛选的测试物质不是特别限定的，但包括核酸(包括VDAC基因的反义核苷酸)，肽，蛋白，有机化合物，无机化合物等等。
本发明筛选方法选作侯选药物的那些测试物质以降低VDAC表达水平为指标。通过这种筛选，有可能挑选出有潜力的能用于预防，减轻或治愈脑炎/脑疾的候选药物。
本发明筛选方法优选的实施方式包括在测试物质存在的系统中测定小型纤溶酶，纤溶酶或纤溶酶原与VDAC蛋白的结合水平，将如此测定的结合水平与在测试物质不存在的系统中测得的小型纤溶酶或类似的物质与VDAC蛋白的结合水平的结果(参照值)相比较，当与参照值相比测试物质有效降低结合水平时，挑选其作为候选药物。这种方法利用了VDAC蛋白功能中的一种，即VDAC蛋白作为受体容许小型纤溶酶，纤溶酶和纤溶酶原与之结合的功能。能够抑制小型纤溶酶及类似物质与作为受体的VDAC蛋白结合的候选物质有利于作为用于治疗脑炎/脑疾的药物。
这种方法可以利用本领域已知的VDAC蛋白和至少一种选自小型纤溶酶，纤溶酶和纤溶酶原的物质，以及检测测试物质对两者之间结合的影响来进行。因此，这种方法可以通过检测测试物质降低(抑制)小型纤溶酶，纤溶酶或纤溶酶原与VDAC蛋白结合的程度来进行。可以用传统的方法对VDAC蛋白与小型纤溶酶，纤溶酶或纤溶酶原的结合水平进行测定，例如利用已知的分别特异于VDAC蛋白，小型纤溶酶，纤溶酶和纤溶酶原的抗体。
通过本发明的筛选方法选择的候选药物包括上面提到的核酸，肽，蛋白等等，以及那些抑制无蛋白酶水解活性的纤溶酶原转化为具有蛋白酶水解活性的小型纤溶酶或纤溶酶，从而阻碍小型纤溶酶、纤溶酶与VDAC蛋白产生结合，也就防止脑炎/脑疾发病的药物，例如纤溶酶原激动子抑制剂，粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，组织蛋白酶D抑制剂，等等。
(4)用于治疗脑炎/脑疾的药物由上述(3)描述的筛选方法挑选出的候选药物有利于作为治疗脑炎/脑疾的药物。因此，本发明进一步提供了含有这样的药物作为活性成分的用于治疗脑炎/脑疾的药剂。
根据本发明，上面提到的治疗剂中的活性成分既可以是利用本发明的筛选方法挑选出的，也可以是依据被挑选出的药物的信息通过化学或生物化学技术或以传统方法在商业基础上制备而得的。
活性成分既可以就这么使用也可以与已知的药学上可接受的载体(赋型剂或稀释剂，填充剂，结合剂，润滑剂，等)混合等等制成药用组合物。万一活性成分是蛋白，药用组合物优选适当地采用各种在通常蛋白制剂中使用的成分，例如稳定剂，灭菌剂，缓冲剂，等渗剂(isotonizing agents)，鳌合剂，pH调节剂，表面活性剂等来制备。
药用组合物的施用根据其制备成的形式既可以是口服，也可以是非肠道给药(口服剂型，如片剂，丸剂，胶囊，粉剂，颗粒剂，糖浆等；非肠道剂型，如注射，输液制剂，外用制剂，栓剂等)。本发明的药用组合物也可以采用可贮藏的制品的形式，通过冷冻干燥溶液制剂制备而成；可以在使用时临时在水，生理盐水或类似缓冲的溶液中溶解到适当的浓度。
本发明的药用制剂含有药理学有效量的活性成分，且其剂量可以根据活性成分的种类，服用途径，年龄，重量和服用对象或病人的症状而改变，但除此之外，本领域的技术人员可在动物测试效果的基础上做适当的选择。
本发明人已经揭示了VDAC在脑炎/脑疾发病中起着重要的作用，而且进一步证明了导致VDAC表达水平升高的因素之一是线粒体中脂肪酸代谢的紊乱。鉴于此，可以考虑通过施用能够恢复或改善紊乱的脂肪酸代谢的药物使得VDAC表达水平正常化，由此产生对脑炎/脑疾治疗和改善的作用。因此，那些依照本发明已诊断为脑炎/脑疾发病的病人，当疑为脂肪酸代谢紊乱时，适当地用药物治疗来改善这种紊乱。这种药物的例证是含有肉毒碱和/或葡萄糖为活性成分的药物。该药物可以采用上面已给出的药用组合物同样的形式，条件是至少含有一种选自肉毒碱和葡萄糖的活性成分。当然，它们也可以是那些已经用作处方药的肉毒碱制剂和/或葡萄糖制剂。
实施例下面给出的实例进一步详细阐述了本发明。
实例1(测试材料和方法)(1)测试病毒菌株，实验动物和试剂-病毒株采用非-亲神经性的流感A/Aichi/68(H3N2)株(由Mr.Masato Tashiro，National Institute of Infectious Diseases提供)。
-实验动物至于野生型的小鼠，采用的是购自Japan SLC，Inc.和Charle River Japan Inc.的正常C57BL/6J小鼠(WT)。采用表现为幼态内脏皮脂腺病的肉毒碱转运蛋白OCTN2-缺陷的C57BL/6J小鼠作为处于线粒体应激状况的模型小鼠(由Assistant Professor MasmichiKuwajima，University of Tokushima School of Medicine提供)(Kuwajima，M.等人，“系统性肉毒碱缺陷的动物模型在与动态内脏皮脂腺病相关小鼠的C3H-H20株中的分析(Animal model of systemic carnitinedeficiencyanalysis in C3H-H2。Strain of mouse associated with juvenilevisceral steatosis)”Biochem.Biophys.Res.Commun.174，1090-1094，1999；Tamai，Z.等人，“有机阳离子/肉毒碱转运蛋白家族在小鼠中的分子和功能特征(Molecular and functional characterization of organiccation/carnitine transporter family in mice)”.J.Biol.Chem.275，40064-40072，2000)。试验中主要选用出生后2天到断奶期(出生后3周)的新生(哺乳期)小鼠，因为小鼠所处的年龄最易发生流感脑炎/脑疾。
-解热剂采用双氯酚酸钠和阿司匹林(乙酰水杨酸)(Sigma)。
-β-氧化紊乱诱导剂肉毒碱拮抗物β-(2，2，2-三甲基肼)-丙酸盐(THP)用作暂时地和可逆地导致体内脂肪酸β-氧化紊乱的试剂，以此诱导出与JVS小鼠中相同的内在状况。
(2)病毒感染的方法在受孕的鸡蛋或MDCK细胞(上皮细胞株)(RIKEN CellEngineering Division所给)中增殖的流感病毒A/Aichi/68(H3N2)用生理盐水稀释，并用4μl的稀释液(1.2×104PFU)在乙醚麻醉状况下鼻内感染3天大的小鼠。用8μl这样的稀释液(3.3×104PFU)在乙醚麻醉状况下鼻内感染断奶期的小鼠。病毒感染后，每日测量体重和死亡数。在进行病毒滴度测定时，动物在乙醚麻醉下使之安乐死，并收集器官用于测定试验。
(3)解热剂和THP的施用在每只小鼠的后颈部每日两次皮下注射25μl份的双氯酚酸钠(1μl/ml)的生理盐水溶液或25μl份的30μl/ml的阿司匹林溶液。以体重为基础，双氯酚酸钠每日的剂量是4mg/kg/日，或阿司匹林是120mg/kg/日。将THP溶解在生理盐水中并用25μl的溶液每日两次在每只小鼠的后颈部位给药。日剂量是300mg/kg/日。
(4)用伊文思蓝测定脑水肿用乙醚麻醉每只小鼠，单在左侧胸腔的骨头处施以胸腔切开术，用微毛细管将10μl的伊文思蓝溶液(20mg/ml的生理盐水)从左心室注入。十分钟后切开右心房，将6倍于体重的生理盐水从左心室灌入取出全身血管中的伊文思蓝，再反萃取出渗入组织中的伊文思蓝并测定含量，作为水肿的指标。
(5)流感病毒RNA的定量为了测定不同器官，如大脑，肺和肝中的流感病毒的RNA，用TRIzol试剂(Gibco BRL)从每种器官中提取总RNA，用1μl的总RNA进行RT-PCR(反转录多聚酶链式反应)来检测病毒。在自动合成仪上合成所用的引物。以流感病毒血细胞凝集素(HA)的核苷酸序列为基础(Verhoeyen，M.，等人，“香港流感株A/Aichi/2/68和A/Victorica/3/75的血细胞凝集素之间的抗原漂移(Antigenic driftbetween the haemagglutinin of the Hong Kong influenza strainsA/Aichi/2/68 and A/Victorica/3/75)”.Nature 286，771-776，1980；Kida，H.等人，“来自中国猪的H3N2流感病毒的血细胞凝集素基因的起源(Origin of the hemagglutinin gene of H3N2 influenza Viruses from pigsin China)”.Virology 162，160-166，1988)，引物P1SEQ ID NO1和P2SEQ ID NO2用在第一次PCR对578bp的检测中。进一步地，P3SEQID NO3和P4SEQ ID NO4用在第二次PCR对232bp的检测中。在实时PCR中，使用荧光标记的探针，P5SEQ ID NO5和P6SEQ IDNO6，与TaqManTM探针(SEQ ID NO7，FAM与5’端结合，TRMRA与3’端结合)一起使用，在ABI Prism 7700(Applied Biosystems)上进行测定。用将流感病毒A/Aichi/68(H3N2)的HA cDNA嵌到pGEM-T载体(Promega)上而构建的质粒制作工作曲线，并用其作为标准工作曲线进行定量。
(6)通过RT-PCR对VDAC mRNA表达水平升高的研究以上面提到的相同的方法依照厂家提供的手册用TRIzol试剂(Gibco)提取试验动物的大脑和肺部RNAs。
(7)通过实时PCR的VDAC的定量用1μl的从组织或细胞中提取的RNA，M-MLV反转录酶，RNA酶H(Promega)和寡(dT)通过反转录反应制备cDNA。以该cDNA为模板，0.3μM的含引物对的反应混合物用QuantiTect SYBRTMGreenPCT试剂盒(Qiagen)来制备，用ABI PRISMTM7700序列检测系统(Applied Biosystems)进行PCR，95℃热变性15分钟后，进行94℃15秒，55-60℃30秒和72℃30秒的循环30-40次，并分析PCR扩增的产物。
VDAC包括三种异构体，下面的引物对(都用自动合成仪合成)被用来检测各自的异构体(小鼠的情况)。
VDAC1，335bp扩增产物正向引物SEQ ID NO8反向引物SEQ ID NO9VDAC2，457bp扩增产物正向引物SEQ ID NO10
反向引物SEQ ID NO11VDAC3，255bp扩增产物正向引物SEQ ID NO12反向引物SEQ ID NO13对于作为内部标准的β-肌动蛋白的检测，SEQ ID NO14的引物用作正向引物，而SEQ ID NO15的引物作为反向引物。
上述RT-PCR得到的cDNA克隆到pGEM-T载体(Promega)上，随后用Prime-a-GeneTM标记系统(Promega)进行同位素标记，以用作蛋白印迹中的探针。
在上述内容中，下面的用于人VDAC检测的引物对可被用于各自的异构体。
VDAC1，181bp扩增产物正向引物SEQ ID NO16反向引物SEQ ID NO17VDAC2，486bp扩增产物正向引物SEQ ID NO18反向引物SEQ ID NO19VDAC3，255bp扩增产物正向引物SEQ ID NO12反向引物SEQ ID NO13(8)通过免疫化学分析检测流感病毒抗原，小型纤溶酶和VDAC用蛋白A SepharoseTM(Amersham Biosciences)纯化通过流感病毒A/Aichi/68(H3N2)免疫家兔而获得的抗体。通过将该IgG穿过固定有小鼠全血清蛋白的SepharoseTM4B柱而除去其中无特异性反应的IgG，而没被吸附的IgG级分被用作第一抗流感病毒的抗体。
利用Murakami，M等人的方法制备特异于小型纤溶酶的第一抗体(Eur.J.Biochem.268，2847-2855，2001)。抗纤溶酶和纤溶酶原的第一抗体是可从American Diagnostica获得的商用产品。
致癌基因的VDAC Ab-5被用作抗VDAC的第一抗体。
每种纯化的特异抗体IgG(1μg/ml)与用缓冲液/低聚甲醛固定的大脑切片在4℃下反应过夜，反应1小时后在室温下与第二抗体反应。然后，依照抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物方法检测每种抗原。
(研究结果和讨论)(1)伴随流感传染的脑水肿在线粒体中，ATP主要是借助乙酰辅酶A(乙酰-CoA)在TCA循环中产生，而且导致乙酰辅酶A水平降低的各种因素是已知的，具体的是在长链脂肪酸代谢途径中通过β-氧化作用经由酰基肉毒碱的紊乱，例如受损的中间脂肪酸代谢，和经由乙酰辅酶A的葡萄糖代谢途径中的紊乱。上面提到的JVS小鼠和给予THP的小鼠都是处于线粒体应激状况下的模型鼠，带有细胞膜水平上诱导的线粒体内膜内长链脂肪酸代谢中的紊乱。
利用这些JVS小鼠对伴随流感感染的脑水肿的时间过程所做的研究结果(脑水肿的测定如上述(4)所描述的用伊文思蓝组织浸入作为指示剂)是，脑水肿的程度加深是流感传染之后时间的函数。与同样方法测试的野生型小鼠(WT)相比，脑水肿程度的加深是明显的，在大脑软组织中观察到伊文思蓝水平随时间而增加。在无流感传染的情况下(不用病毒感染的小鼠中)进行的同样试验中，WT或JVS小鼠都没有观察到脑水肿。因此很明显，线粒体应激诱导对脑水肿的敏感性的升高，而其自身并不触发脑水肿，在该测试系统中流感病毒感染触发了它。
(2)大脑中的流感病毒抗原和小型纤溶酶流感感染的JVS小鼠的大脑中的病毒抗原和小型纤溶酶的免疫化学着色证实感染后几天，伴随着病毒在大脑血管内皮上的增殖，小型纤溶酶在大脑血管内皮上开始聚集。至于在大脑中聚集的小型纤溶酶，据估计小型纤溶酶在肺部的炎症部位大量产生，然后在血液流动中运输到全身并特别地在大脑血管内皮上聚集。
图1a(RT-PCR)中，相对显示了WT和JVS小鼠感染后的大脑(图中的“大脑”)，肺(图中的“肺”)，肝脏(图中的“肝脏”)和血液(图中的“血液”)中流感病毒基因组的拷贝数。图中“1st-PCR”和“2nd-PCR”分别指的是在上面提到的RT-PCR中的第一次PCR和第二次PCR，“GAPDH”指的是内在标准的结果。图中的泳道中“M”显示的是标志(DNA梯度标志)。
图1b(实时PCR)中，比较显示了WT和JVS小鼠感染后的大脑(图中的“大脑”)，肺(图中的“肺”)，和肝脏(图中的“肝脏”)中流感病毒基因组的拷贝数。图中纵坐标表示通过上面提到的实时PCR测定的病毒基因组的拷贝数(对数值IAV log10拷贝数/μg总RNA来表示)，黑色柱形图显示在JVS小鼠的结果，白色柱形图是在WT小鼠的结果。
图1显示的结果证实了，WT和JVS小鼠的肺部没有观察到病毒复制数量上有大的区别，而在JVS小鼠的大脑和肝脏中病毒的复制要比其在WT小鼠中快几百到几千倍。
(3)小型纤溶酶与VDAC蛋白之间的结合水平将人源的纤溶酶原，小型纤溶酶和小纤溶酶以每种50ng的量在硝酸纤维素膜上印迹成圆点，然后与100ng/ml的纯化的小鼠VDAC蛋白溶液反应。结合的VDAC蛋白用抗VDAC蛋白的抗体(Oncogene)和ECL化学发光试剂(Amerisham)检测。通过文献(Bureau，M.H.，等人，“分离和克隆来自哺乳动物大脑的电压依赖的阴离子通道样分子量36,000多肽(Isolation and cloning of a voltage-dependent anionchannel-like Mr 36,000 polypeptide from mammalian brain)”，J.Biol.Chem.，267，8679-8684，1992)描述的方法制备纯化的小鼠VDAC蛋白溶液。
结果显示在图2中。
图2显示的结果指出了下面的内容。纯化的VDAC蛋白与具有Kringle结构域1-5的纤溶酶原和具有Kringle 5的小型纤溶酶结合，但不与无Kringle结构域的微纤溶酶结合。这就清楚地说明至少Kringle5结构域涉及与VDAC蛋白的结合。
VDAC蛋白是在线粒体外膜上发现的通道，其在细胞膜上的表达也已经被证实。在鼠科动物的大脑中发现VDAC蛋白在细胞膜上比在线粒体中还要大量表达。那么，估计小型纤溶酶与VDAC蛋白之间的结合是通过Kringle 5实现的，由此小型纤溶酶与供作受体的VDAC蛋白一起在细胞膜上聚集下来。
(4)VDAC表达水平有三种VDAC的异构体(VDAC-1，-2，-3)。当大脑处于正常的情况时，WT小鼠大脑中VDAC的表达是在一个相对较低的水平上。但是当大脑暴露于诱导流感脑炎/脑疾的物质中时，VDAC表达升高并产生一种脑水肿预备状况(敏感性增加的状况)。具体而言，在这种状况下脑水肿很少被观察到，但当伴随流感病毒感染时，严重的水肿自身就表现出来了。
在该测试中，检测了在用不同药物处理和/或流感病毒感染的WT小鼠的大脑中VDAC-1 mRNA的表达水平(依照上面描述的RT-PCR)。
以下述方式进行测试用流感病毒鼻内感染正在哺乳的WT小鼠，感染后5天测定VDAC-1 mRNA的水平(a组)；以300mg/kg/日的剂量给WT小鼠施用肉毒碱拮抗物THP 5天，然后用同样的方法测定VDAC-1 mRNA的水平(b组)；以300mg/kg/日的剂量给流感病毒感染的WT小鼠施用肉毒碱拮抗物THP 5天，然后用同样的方法测定VDAC-1 mRNA的水平(c组)；或以120mg/kg/日的剂量给流感感染的WT小鼠施用阿司匹林5天，然后用同样的方法测定VDAC-1 mRNA的水平(d组)。对照组中通过注射将生理盐水施用给没有用流感感染的WT小鼠(e组)。每组含2只小鼠。
通过上述方法得到的结果显示在图3中(RT-PCR分析的结果)。
图3中，W表示测试小鼠(WT)。对于各自泳道，“感染”下面的符号具有下面的含义-(减号)表示没有流感感染的组(对照组)；+(加号)表示用流感病毒感染的组(a组)；THP表示仅用THP处理的组(无流感感染，b组)；THP+表示流感感染和用THP处理的小鼠的组(c组)；以及A+表示流感感染和用阿司匹林处理的小鼠的组(d组)。
图3显示的结果清楚地指出了下面的内容。a组中在大脑中观察到VDAC-1表达水平显著的升高。b组和c组中，即处于线粒体应激状况，特别是脂肪酸代谢紊乱的组中，通过肉毒碱拮抗物THP处理诱导，观察到VDAC-1显著的升高。在用已知是雷氏症候群诱导物质的阿司匹林处理的d组中，也观察到了VDAC-1表达的升高。
(5)在大脑和肺中VDAC-1，VDAC-2和VDAC-3的表达水平为了进一步详细研究上面(4)中所显示的结果，WT小鼠的大脑和肺部中的VDAC-1，VDAC-2和VDAC-3的mRNA用上面提到的实时PCR在下面的组中测定。
C组施用生理盐水的对照WT组(无流感感染)；I组流感感染后5天的WT组；A组施用120mg/kg/日阿司匹林5天的WT组；A+I组流感感染第一天及其后施用120mg/kg/日阿司匹林5天的WT组；D组施用4mg/kg/日双氯酚酸钠5天的WT组；THP组施用300mg/kg/日THP 5天的WT组；THP+I组流感感染第一天及其后施用300mg/kg/日THP 5天的WT组。
每组含有5只测试小鼠，且获得的结果是以每组中五只动物的平均值显示。用StatviewTM4.0软件以不配对t试验的方法测验与C组相比的区别，以确定显著性。
结果按照各VDAC与作为内部标准的β-肌动蛋白相比的相对水平显示在图4-6中。
每幅图用图形来表示表达水平，其获得是以实时PCR测定的结果为基础。在每幅图中，上图显示的是大脑中的表达水平，下图显示的是肺部的表达水平。图4显示的是VDAC-1表达水平的测定结果；图5显示的是VDAC-2表达水平的测定结果；以及图6显示的是VDAC-3表达水平的测定结果。
各自图中显示的结果指出下面的内容。与生理盐水处理(C组)相比，在流感感染组(I组)，施用阿司匹林组(A组)，施用双氯酚酸钠组(D组)和施用THP组(THP组)的大脑和肺部都观察到了各自VDAC mRNA表达水平的升高，尽管分别根据VDAC-1，-2和-3，对表达水平升高的敏感性有所不同。
对于VDAC-1和-2，在大脑中观察到表达水平的升高是对上述处理直接响应，而VDAC-3的水平是在肺部灵敏地响应。这些事实指出在人源VDAC表达的研究中，个体中VDAC的表达情况，因此这种个体在大脑中的(脑水肿预备状况)表达情况和程度可以通过研究在除大脑之外的其他器官中，如脊髓液或外周血液中的白细胞里的VDAC表达的改变来估计。
(6)在JVS小鼠大脑中VDAC蛋白的表达鼻内流感病毒感染后的JVS小鼠的大脑血管内皮和神经细胞中的VDAC表达的升高是在各自组织用伊文思蓝染色(免疫化学染色)后通过显微镜来检查的。
无流感感染的JVS小鼠的大脑的显微照相结果显示在图7中，流感感染后5天的JVS小鼠大脑的显微照相结果显示在图8中。
图7中，照片a)和c)放大倍数低(×140)，b)，和d)放大倍数高(×420)。如图7所示，血管内皮没有被染色，而神经细胞被染上了颜色，如d)所示。
图8中，照片a)和d)放大倍数低(×140)，b)，c)和e)放大倍数高(×420)。如图中a)到c)所示，VDAC蛋白的表达水平在病毒感染后的血管内皮细胞中特异且显著地升高。在神经细胞中表达也有所升高，参见d)和e)。
在带有线粒体内膜中长链脂肪酸代谢紊乱的JVS小鼠中，大脑中VDAC表达水平与WT小鼠相比稍微高一些。如图7所示，观察到VDAC表达主要是单独在神经细胞中，而在血管内皮中不能清楚地断定。但是，鼻内流感病毒感染后5天的大脑中，观察到了在大脑血管内皮中VDAC表达显著升高，在神经细胞中也有所升高，如图8所示。用在对照试验中的无免疫性的IgG完全不能着色到任何样品上，尽管这里没有显示；因此，图7和8中探测到的蛋白估计是由于与VDAC抗体特异反应而着色的结果。
鉴于前面的内容，流感脑炎/脑疾的发病的机理可以作如下估计。不同的因素(解热剂，抗痉挛药，抗生素，不同的病原体感染，先天的脂肪酸代谢紊乱，等等)造成了脑水肿发病的预备状况(对脑水肿高度敏感的状况)，且当不同的感染，特别是流感病毒感染或其它的由于不同因素导致的炎症反应以这种状况下出现时，流感脑炎/脑疾自身就表现出来了。
(7)讨论当VDAC表达非正常升高时，估计由此产生脑水肿预备状况(对脑水肿高度敏感的状况)，另外的病原体感染引发进一步的VDAC表达的升高或者由于体内的炎症反应而产生小型纤溶酶并在大脑血管内皮中聚集，血脑屏障自毁或表现出不稳定，导致脑炎/脑疾的发病。作为脑炎/脑疾特异的触发因素，尤其可被提到的是，流感病毒感染和其它病毒感染，例如RS病毒，腺病毒，麻疹病毒，脊髓灰质炎病毒和疟疾感染。除了致病微生物感染之外，不同的炎症反应也被估计是加入到对脑水肿高度敏感的状况中导致脑炎/脑疾的发病。因此，如本发明所揭示的，通过检查VDAC表达水平，对预脑水肿发病状况(对脑水肿高度敏感的状况)的检查成为可能。进一步地，重要的是检测VDAC表达水平作为一种测试和判断解热剂，抗痉挛药，抗生素或类似的抗流感脑炎/脑疾的药物的安全性的方法。根据本发明的诊断方法非常有利于作为一种新的能够诊断雷氏症候群，流感脑炎/脑疾和由于先天的脂肪酸代谢紊乱而似雷氏症候群的病人是否处于脑炎/脑疾发病预备状况的方法，进一步地作为一种在损伤或创伤或手术场合预先诊断对脑水肿发病敏感性的方法。
工业实用性本发明提供了一种检测脑炎/脑疾发病及其风险的方法。该方法可以通过检测VDAC表达水平来检查脑水肿发病预备状况(对脑水肿高度敏感状况)。本发明进一步提供了一种判断施用或应用诸如解热剂，抗痉挛药或抗流感的抗生素的药物是否安全(是否具有诱导流感脑炎/脑疾的风险)的方法。本发明进一步提供了一种用于筛选可用来治疗脑炎/脑疾的药物的方法。这些方法在作为诊断，治疗和预防脑炎/脑疾技术的药物领域是有益的。
序列表<110>木户博(HIROSHI KIDO)<120>检测脑炎或脑疾发病风险的方法(A method of determining the risk of developing encephalitis/encephalopathy)<130>SCT053418-47<150>JP 2003-51678<151>2003-02-27<160>19<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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权利要求
1.一种脑炎/脑疾的检测方法，包括制备获自疑似脑炎/脑疾发病的病人的含电压依赖的阴离子通道(VDAC)的样品，测量样品中VDAC的表达水平，并以所述表达水平的升高作为指标检测脑炎/脑疾的发病和发病敏感性(发病风险)。
2.根据权利要求1的检测方法，其中的脑炎/脑疾是流感脑炎/脑疾。
3.根据权利要求1的检测方法，其中VDAC表达水平的测量是以测量VDAC基因转录的方式进行的。
4.根据权利要求1的检测方法，其中VDAC表达水平的测量是以测量VDAC蛋白的方式进行的。
5.根据权利要求1的检测方法，其中VDAC包括至少一种选自由VDAC-1，VDAC-2和VDAC-3组成的组的同工型。
6.一种确定由药物导致的脑炎/脑疾发病风险的方法，包括在所述药物存在的系统中测定表达VDAC的细胞中VDAC的表达水平，将所述表达水平与在所述药物不存在的系统中所测得的表达VDAC的细胞中VDAC的表达水平相比较，并利用两者之间表达水平的差异作为指标确定由药物导致的脑炎/脑疾的发病风险。
7.根据权利要求6的确定由药物导致的脑炎/脑疾发病风险的方法，其中所述药物存在的系统是通过给测试动物施用药物而形成的。
8.根据权利要求6的确定由药物导致的脑炎/脑疾发病风险的方法，其中所述药物存在的系统是通过将药物添加到表达VDAC的细胞的培养液中而形成的。
9.一种筛选用于脑炎/脑疾治疗的候选药物的方法，包括在测试物质存在的系统中测定表达VDAC的细胞的VDAC表达水平，将由此测定的表达水平与在所述测试物质不存在的系统中所测得的表达VDAC的细胞的VDAC表达水平相比较，后者作为参照值，以及当与参照值相比测试物质对降低表达水平有效时挑选其作为候选药物。
10.一种筛选能够抑制小型纤溶酶，纤溶酶或纤溶酶原与作为受体的VDAC结合的候选药物的方法，该方法包括在测试物质存在的系统中测量小型纤溶酶，纤溶酶或纤溶酶原与VDAC蛋白的结合水平，将由此测得的结合水平与在测试物质不存在的系统中测得的小型纤溶酶，纤溶酶或纤溶酶原与VDAC蛋白结合的水平相比较，后者作为参照值，以及当与参照值相比测试物质对降低结合水平有效时挑选其作为候选药物。
全文摘要
本发明提供了一种检测脑炎/脑疾发病及其风险的方法；一种判断药物的施用或应用是否安全(是否具有诱导流感脑炎/脑疾风险)的方法；和一种用于筛选可用在脑炎/脑疾治疗中的药物的方法。检测方法包括制备获自疑似脑炎/脑疾发病的病人的含电压依赖的阴离子通道(VDAC)的样品，检测样品中VDAC的表达水平，并以所述表达水平的升高作为指标检测脑炎/脑疾的发病和发病敏感性(发病风险)。
文档编号G01N33/53GK1756957SQ20048000555
公开日2006年4月5日 申请日期2004年2月27日 优先权日2003年2月27日
发明者木户博 申请人:木户博