预测肾近曲小管细胞毒性的体外试验的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年7月20日提交的美国临时申请第61/674, 018号，以及2012 年7月25提交的美国临时申请第61/675, 680号的优先权和权益，其内容通过引用纳入本 文。
技术领域
[0003] 本发明涉及用于预测化合物对于肾近曲小管细胞的毒性（包括预测体内毒性）的 体外试验方法。
【背景技术】
[0004] 肾是药物诱导毒性的主要靶器官之一。肾毒性药物和化学品会诱导急性肾损伤 (AKI)或慢性肾病，随后发展成晚期肾病（ESRD) (1-3)。AKI和ESRD患者具有上升患病率和 死亡率，并且依赖于透析（1，4, 5)。所有住院患者中有约5%而I⑶患者中有约20% -30% 发展成AKI，并且这些病例中有约20%-25%归因于肾毒性药物（2-4)。当替代性药物和新 药投入使用时，其肾毒性可能性通常被低估(6)，这再次导致临床并发症，如COX2抑制剂的 情况（7)。
[0005] 通常而言，仅在药物开发的晚期才检测肾毒性，并且导致临床前研宄期间药物缩 减中的2%和3期中的19% (8)。并且，由于肾的大功能储备，肾毒性效应常常仅在监管方 面批准之后变得明显。一个近期示例是替诺福韦，其损伤肾近曲小管（9, 10)。并且，上述 问题还与加入临床试验的患者和对象的风险升高，以及保健系统和制药业的基础成本相关 联。
[0006] 一个主要问题是缺乏具有高度可预测性的临床前模型。动物模型的可预测性受种 间差异性的影响，并且还存在其它问题，例如高成本和低通量。此外，欧盟（EU)的法制变化 (REACH和化妆品指令的第七次修正）以及美国的新法案（ToxCast和Tox21)提高了对体外 模型的兴趣。经监管批准或验证的预测人类肾毒性的体外模型目前尚不可用。主要困难在 于对合适细胞类型和终点的鉴定（11-13)。
[0007] 在肾中，肾近曲小管（PT)细胞是药物诱导的毒性的主要目标，这归因于其在药物 及有机化合物运输和肾小球过滤物浓缩中的作用（2,3)。PT源性的细胞系，例如人和猪细 胞系HK-2(人肾-2)和LLC-PKl (Lewis肺癌-猪肾1)，已在体外肾毒理学中频繁应用。然 而，永生细胞的敏感性低于人原生肾近曲小管细胞（HPTC) (14)并且对熟知的肾毒性物质 不敏感（13)，这归因于与永生化相关联的功能变化和药物转运体表达变化（15-17)。此外， 与一般细胞毒性相关联的终点，例如细胞死亡、代谢活性或ATP损耗，均不能用于器官特异 性毒性的研宄。检测用肝毒性、肾毒性和心脏毒性化合物处理肝脏、肾PT和心脏源性细胞 系的ATP损耗的近期研宄发现，大多数化合物对所有三种细胞系具有相似作用（18)。
[0008] 管控替代性方法的审核与批准的欧洲和美国监管机构（欧洲动物实验替代方法 验证中心（ECVAM)和毒理学替代评估国家跨部门毒理学规划评价中心/替代方法验证跨 部门协调委员会（NICEATM/ICCVAM))目前尚未对体外肾毒理学的验证方法采取任何措施。 ECVAM已经对一项采用15种药物的验证前研宄给予了基金支持（19)。已采用有限数量的 药物测试了在此后的过去10年间开发的用于体外肾毒理学的其它模型（20-24)，但其可预 测性不明。近期开发的高通量线粒体肾毒性物质试验基于兔细胞（25);非人类的动物模型 的应用可能会引发关于种间差异性的问题。在采用新鲜分离自鼠肾的PT的模型中也是相 同情况（23, 24)。
【发明内容】
[0009] 本发明的方法涉及用于预测化合物的肾近曲小管毒性的体外试验，且所述体外试 验可包括预测体内毒性。所述方法利用肾近曲小管细胞中的IL-6和/或IL-8的表达水平 来评估测试化合物的毒性。
[0010] 所述体外试验可采用人细胞进行，因此可提供用于预测对于人体中肾近曲小管的 毒性的模型。
[0011] 在一些情况中，所述模型的可预测性可以相当高，例如，约76% -85%。
[0012] 当作为人类疾病的模型使用时，所述方法可允许预测药物开发过程中的早期临床 前阶段的肾近曲小管毒性。所述预测能力对于开发较安全的药物而言具有重要性，并且对 于肾毒性的早期预测可协助在药物开发过程中节约大量成本。
[0013] 在一个方面，本发明提供用于筛选化合物的肾近曲小管毒性的体外方法。所述方 法包括，使测试化合物与肾近曲小管细胞的测试群接触；和，测定所述测试群中白介素的表 达水平，所述白介素是白介素-6(IL-6)或白介素-8(IL-8)或上述两者。若所述测试群中白 介素的表达水平大于未与所述测试化合物接触的肾近曲小管细胞的对照群中的表达水平， 则指示所述测试化合物对肾近曲小管细胞具有毒性。
[0014] 对于白介素表达水平的测定可包括：测定编码白介素的mRNA的水平，并且可包括 定量PCR技术、northern印迹技术、微阵列技术、TRAC技术、焚光标记物技术和磷光体成像 (phosphorimaging)技术中的一种或多种。
[0015] 对于白介素表达水平的测定可包括：测定分泌的白介素蛋白的水平，并且可包括 ELISA技术、生物传感器技术、电化学检测技术、免疫印迹技术、流式微珠阵列技术、荧光标 记物技术和受体结合技术中的一种或多种。
[0016] 对于白介素的表达水平的测定可包括检测在IL-6或IL-8调节控制下表达的报告 基因的水平。
[0017] 若测试群中白介素的表达水平与对照群中白介素的表达水平的比率是约1.5或 更高，或约3. 5或更高，则指示所述测试化合物对肾近曲小管细胞具有毒性。
[0018] 所述肾近曲小管细胞可源自体细胞或源自干细胞。在一些实施方式中，所述肾近 曲小管细胞源自体细胞或可以是原生细胞或来自稳定细胞系的细胞，包括例如人原生肾近 曲小管细胞、HK-2细胞或LLC-PKl细胞。
[0019] 肾近曲小管细胞可源自干细胞，并且可以从胚胎干细胞、间充质干细胞或诱导性 多能干细胞分化而来。
[0020] 在一些实施方式中，所述近曲小管细胞是人肾近曲小管细胞。在一些实施方式中， 所述近曲小管细胞是非人肾近曲小管细胞。
[0021] 所述接触可进行约8小时或更久的时间。所述接触可以是在约3~约14天的一 段时间内重复一次或多次。
[0022] 所述接触可包括向所述肾近曲小管细胞测试群添加浓度为约0.001~约 1000 μ g/ml的测试化合物。
[0023] 所述测试群可以是融合单层、亚融合单层、融合上皮、类器官培养物、融合2D培养 物、体外小管、3D类器官培养物或在静态或微流条件下培养的3D培养物。
[0024] 本领域技术人员根据本发明下面的【具体实施方式】的描述以及附图将会明白本发 明的其它方面和特征。
【附图说明】
[0025] 本申请的附图如下所述，其仅通过示例方式说明本发明的实施方式。
[0026] 图1.响应肾毒素的标志物基因表达。源自不同供体的两个批次的HPTC(1和4) 用2. 5mg/ml庆大霉素（浅灰色柱形）和10 μ g/ml CdCl2 (深灰色柱形；载体对照：白色柱 形）处理。应用这些肾毒素的高剂量以排除因剂量问题所致的缺乏响应。X轴上所指示的 标志物基因的相关表达水平通过qPCR测定（参见表19的引物（图27))。柱形显示相比于 载体对照的平均倍数表达+/_标准偏差（s.d. ;n = 3)。将各实验的载体对照的平均值设 定为1。相对于载体对照的显著性差异（P〈〇. 05)由星号表示。
[0027] 图2.剂量响应曲线。使HPTC 1接触近曲小管（PT)-特异性肾毒素（组1，左图）， 对近曲小管无毒的肾毒素（组2,中图）或无肾毒性化合物（组3,右图），其浓度按X轴指 示（标注对数刻度）。该图显示IL-6 (灰线）和IL-8 (黑线）相对于载体对照的表达水平 (平均值+/-S. d.)。在顺铂情况中，在测试的最高浓度出现细胞大量死亡。
[0028] 图3.灵敏度、特异度和与临床数据的总体一致性。该图以图示形式显示表5中所 示的灵敏度和特异度的百分比。此外，该图显示与临床数据的总体一致性。分别对三个不 同批次的HPTC以及HK-2和LLC-PKl细胞进行计算。阈值（X轴）范围是0. 3-4. 0。80%的 值由点线指示以便于比较。
[0029] 图4.受者工作特征（ROC)曲线。计算对于各细胞批次/类型的各单一标志物或 两种标志物的组合的ROC曲线。对应的曲线下面积（AUC)值总结于表6。为了比较，图F同 时显示测试的所有不同细胞批次/类型获得的ROC曲线（两种标志物组合）。
[0030] 图5.在四个不同批次的HPTC(l-4)中通过qPCR测定的标志物基因表达。（X 轴）指示的31个基因的相对表达水平以GAPDH表达的百分比显示（y轴）。柱形显示平 均值+/_标准偏差（s.d. ;n = 3)。由于表达水平不同，不同图表的y轴上的标度不同，并 且对于a平滑肌肌动蛋白（SM)和波形蛋白（VIM;底图）采用log标度。除了转分化和 脱分化的这两种标志物以外，以下上皮、HPTC特异性、肾和肾损伤特异性标志物包括：水 通道蛋白-I (AQPl)、氨肽酶N(CD13)、闭锁小带I (Z0-1)、N-钙粘蛋白（N-CAD)、E-钙粘蛋 白（E-CAD)、γ-谷氨酰转移酶（GGT)、25-羟基维生素 D31a-羟化酶（VIT D3)、葡糖转运 子5(GLUT5)、Na+/K+ATP酶、肾特异性钙粘蛋白（KSP-CAD)、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质 运载蛋白（NGAL)、肾损伤分子-I(KIM-I)、维尔姆氏（Wilms'）肿瘤基因 I(WTl)、成对盒 基因 2(PAX2)、多抗药基因 I (MDRl)、Megalin 蛋白（MEG)、Na+HC03-共转运子 I (NBCl)、有 机阴尚子转运子I (OATl)、0AT3、有机阳尚子转运子I (OCTl)、有机阳尚子/肉毒碱转运子 2 (0CTN2)、质子偶联肽转运子2 (PEPT2)、钠依赖性葡萄糖共转运子2 (SGLT2)。此外，包括 对肾单位的其它部分具有特异性的如下标志物：足糖萼蛋白（podocalyxin)样（PODXL,肾 小球）、氯离子通道Kb (CLCNKB，远侧肾单位）、噻嗪敏感性钠-氯共转运子（NCCT，远端小 管）、Na+/K+/2Cl-共转运子（NKCC2, Henle髓袢升支粗段）、尿调素（UMOD，Henle髓袢升支 粗段和远端肾曲小管）和AQP3(集合管）。引物参见参考文献27和28以及图27 (表19)。 分析第1代（P)的HPTC。本文所示结果与我们先前采用培养至P 5的HPTC所获得的结果 一致（参见参考文献27)。例如，与我们先前采用更高传代数的HPTC所获得的结果一致， 0AT3和OCTl以极低水平表达，并且HPTC以相对高的水平表达一些在肾单位/肾的其它部 分体内表达的标志物（NCCT和AQP 3)。并且，VM以高水平在体外表达的结果也与先前结 果一致（参考文献27和46)。一些HPTC特异性标志物，如GGT、⑶13和ZO-I以低水平表 达（在获自ATCC的HPTC 1中有约0. 4%的GAPDH表达）。在GGT定量PCR数据已于先前 公开（A. Saito, K. Sawada 和 S. Fujimura, Hemodial Int, 2011，15, 183-192.)的情况下，其 与本文观察到的低表达水平相一致。然而，GGT在获自ATCC的HPTC中有功能（参考文献 27和28)并且⑶13以及ZO-I可通过免疫印迹和免疫染色检测到（参见图6)。
[0031] 图6.通过免疫染色和免疫印迹测定的HPTC 1和4中的标志物表达。通过免疫染 色检测的（A)ZO-l、（B)URO-IO和（C)⑶13。紧密连接蛋白ZO-I被组织进入特征性细铁丝 网状图样指示形成了广泛的紧密连接。比例尺：50μπι(Α和C)和100μπι(Β)。（D)⑶13和 Na+/K+ATP酶的α亚基通过免疫印迹检测。采用α-微管蛋白作为上样对照。IOOkDa和 50kDa分子大小标志物条带的位置示于左侧。抗体和免疫印迹和免疫染色方法描述于参考 文献27。
[0032] 图7.术语和定义。该象限图（matrix)说明与阳性⑴和阴性㈠ 临床和体外 结果相关的真阳性（TP)、假阳性（FP)、假阴性（FN)和真阴性（TN)的定义。提供性能度量 (performance metrics)的定义。
[0033] 图8. GAPDH水平和细胞数。通过qPCR测定GAPDH水平（蓝色线）并且通过HCS 对细胞数量计数（红色线）。所示图表显示以不同浓度（X轴）的指示化合物测定的值（平 均值+/-s.d.，n = 3)。所有值以载体对照的百分比表示。用HPTC 1获得结果。
[0034] 图9.(表1)测试化合物和IL-6和IL-8在HK-2和LLC-PKl细胞中的最高表达水 平。该表列出41种测试化合物，其被分为三组。组1 (化合物1 - 22)代表直接损伤PT的肾 毒素。组2 (化合物23 - 33)包含不直接损伤PT但通过不同机制损伤肾的肾毒素。组3 (化 合物34 - 41)代表非肾毒性化合物。使HK-2和LLC-PKl细胞接触1 μ g ml-1~