路易斯）。采用生物技术级别的水（1st Base公司，新加坡）制备如下测试化合物的可能的储液（10mg/ml):化合物1、2、4-6、9-18、 23、25、28、30-36和40。或者采用二甲亚砜（DMS0 ;西格玛奥德里奇公司；化合物3、7、8、19、 22、27和 41)或乙醇（化合物 20、21、24、26、29、37和39)制备储液（6.811^/1111-10011^/1111，视 个体化合物的溶解度而定）。载体对照试验采用相应溶剂进行。所有储液避光储存于4°C。 金属氧化物和无机盐（化合物11-16和18)的储液储存至多6个月。有机化合物的储液储 存不超过3个月，且大多数储液在广泛系列测试过程中消耗得快得多。
[0111] 细胞培养：HPTC购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯； HPTC 1)或按照描述（26)分离自肾切除样品（HPTC 2-4)。采用4代（P)和P5的市售的 HPTC (HPTC 1)，以及P3和P4的HPTC 2-4。肾切除样品源自肿瘤患者，并且由病理学家在检 测后选择正常组织区域分离HPTC。相应的匿名化的正常组织样品获自国立大学医学组织的 组织库（NUHS，新加坡）。HK-2和LLC-PKl细胞购自ATCC。按照描述，在供应商推荐的培养 基中培养不同细胞类型（14)。用于HPTC的培养基包含0.5%胎牛血清。采用所用的人肾 样品（DSRB-E/11/143)和细胞类型（NUS-IRB编号：09-148E)进行研宄已获机构审查委员 会（Institutional Review Board)批准。所有细胞在使用前均经冷藏。
[0112] 为了确保合适的细胞质量和标志物表达概况，采用31种标志物基因通过定量实 时聚合酶链式反应（qPCR)评估所有批次的HPTC (图5)。在蛋白质水平，通过免疫染色和免 疫印迹确认了一些标志物的表达（图6)。对于方法，抗体和引物参见表19 (图27)(也见参 考文献27, 28)。
[0113] qPCR:将细胞以50,000个细胞/cm2的密度接种至24孔微板（Nalgene Nunc， 美国纽约州彭菲尔德）。细胞培养72小时，然后用测试化合物处理16小时。总RNA采用 ]^!1〇16〇80111@1?隱11(1&1〇116代7-似861，德国迪伦）或1^1^6&8)^|)迷你试剂盒（凯杰公司 (Qiagen)，德国希尔登）分离。cDNA采用Superscript? III First Strand合成系统（英杰 公司（Invitrogen)，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）和MyCycler?热循环仪（伯乐公司 (Bio-Rad)，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）合成。然后采用7500快速实时PCR系统（应用 生物系统公司（Applied Biosystems)，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）进行qPCR(至多40 个循环）。按照生产商说明，采用装置中内含的软件进行各程序。采用Sequence Detection Software 7500 Fast 2.0. 5版软件进行数据分析。用2-Λ Λ CT方法测定基因表达水平。引 物用Primer Express Software 3.0版软件设计。所用引物（购自西格玛奥德里奇公司） 的详情于参考文献27、28和表19提供。
[0114] 高内涵筛选（HCS) :HPTC和HK-2细胞以50, 000个细胞/cm2的密度接种至96孔 微板（Becton Dickinson公司，美国新泽西州富兰克林），而LLC-PKl细胞以16, 000个细 胞/cm2接种。细胞培养72小时，然后用测试化合物处理16小时。用内含3. 7%甲醛的 磷酸盐缓冲盐水固定10分钟后，细胞核用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（Merck)染色，并用 ImageXpress Micro高内涵筛选系统（分子设备公司（Molecular Devices)，美国加利福尼 亚州桑尼维尔）成像。各细胞类型、药物和浓度进行3个重复。对3孔中的每一孔获取9 张图像。对个体图像进行细胞核计数，并从这些数据获得每孔的平均细胞数量。数据获取 和分析通过MetaXpress2. 0 (分子设备公司，美国加利福尼亚州桑尼维尔）进行。
[0115] 数据分析：采用Microsoft Office Excel 2003进行所有计算。若在测试的任何 化合物浓度下，有至少一种标志物基因（IL-6或IL-8)的表达增加等于或高于阈值，则在体 外模型中将该化合物定义为阳性并预测为PT特异性肾毒素。检测0.3~4.0的阈值。标 准定义如图7中所示并提供。真阳性（TP)定义为在体外模型中给出阳性结果的人PT特异 性肾毒素（表1，化合物1-22,组1)。真阴性（TN)定义为在体外模型中给出阴性结果的非 肾毒性化合物（表1，组3,化合物34-41)或不损伤人体内的PT的肾毒性化合物（表1， 组2,化合物23-33)。灵敏度通过将TP数量除以PT特异性肾毒素（组1，化合物1-22)的 总数来计算。特异度通过将TN数量除以非PT损伤性化合物（组2和3,化合物23-41)的 总数来计算。平衡的精度定义为灵敏度和特异度的平均值。阳性预测值（PPV)通过将TP 数量除以通过该体外模型鉴定为阳性的总数来计算。阴性预测值（NPV)通过将TN数量除 以通过该体外模型鉴定为阴性的总数来计算。与临床数据的一致性如下计算：TP+TN/41种 药物的总数。提供百分比时，将数字乘以100%。受者工作特征（ROC)曲线通过对0.3-4. O 的所有阈值（与图3中相同的阈值）处的（1-特异度）标绘灵敏度来生成。统计学分析采 用不成对t检验（Microsoft Office Excel 2010)。数据的正态分布采用SigmaStat (3. 5) (Systat软件公司，美国伊利诺斯州芝加哥）确认。
[0116] 结果
[0117] 模型设计和终点：我们选择HPTC作为细胞模型用于开发方法以避免动物细胞和 细胞系相关的问题。所有批次HPTC均通过显微实验和qPCR常规表征，所示qPCR用于测定 31种不同标志物基因的表达水平（参见图5和材料与方法）。在蛋白质水平，通过免疫染 色和免疫印迹确认一些标志物的合适表达（图6)。这些分析确保合适且可比的细胞表型和 质量。细胞在常规未被覆的多孔板中培养。未被覆的组织培养聚苯乙烯使HPTC性能持续 优于有或没有胞外基质覆层的其它材料（29, 30)。细胞在药物处理之前以高密度接种并培 养三天，以允许形成分化的上皮，其如上所述在对照实验中进行确认（数据未显示）（14)。 细胞分化状态对于获得细胞类型特异性的响应而言极其重要。
[0118] 首先，我们通过评估涉及PT损伤的不同标志物基因的表达行为来确定合适终点。 这些包括间充质标志物波形蛋白（VIM)。损伤后，肾损伤分子-I (KIM-I)和嗜中性粒细胞明 胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL)均在小管上皮中上调，并且对AKI的早期检测而言是潜在的 新型生物标志物（31-35)。白介素（IL)-IS在患病和损伤的肾中的PT上皮中上调，并且可 能是用于检测肾毒性的有用生物标志物（31，36, 37)。
[0119] IL-6和IL-8在PT和PT源性细胞中体内和体外表达（14, 38-41)并且在促炎性 过程中起重要作用，其在损伤后出现。不同研宄显示，IL-6和IL-8在受损和患病肾中上调 (42-44)。认为促炎性细胞因子在AKI (包括肾毒素诱导的AKI)中起重要作用（45)。此外， 已在肾培养模型中采用纯化的PT证明与肾毒素接触后，IL-6显著上调（24)。
[0120] 为了测定肾毒素对这六种标志物基因的体外作用，两个不同批次的HPTC用高剂 量的庆大霉素和CdCl 2处理，并用qPCR分析表达水平。所有单个结果均标准化至表达水平 甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH)，其与细胞数量一致（图8)。如果特定标志物基因的表达适 合于作为终点，则该基因应在未处理细胞中显示相对低表达，而响应肾毒素显示高水平的 诱导。此外，所述基因应响应不同肾毒素并在不同批次的HPTC -致上调。图1显示IL-6 和IL-8满足这些标准。就测试的标志物基因而言，在用肾毒素处理后，IL-8显示最高水平 的上调。
[0121] NGAL也显示一致上调，但其上调水平仅为1. 8倍~3. 5倍，这低于IL-6和IL-8的 上调水平。VM仅在一个细胞批次中上调。KM-I和IL-18仅在一个细胞批次中响应一种 化合物上调。就NGAL(脂质运载蛋白-2)和KM-I而言分别观察到低水平或缺乏上调，这 与采用人肾近曲小管细胞和PT源性细胞系的其它体外模型的结果一致（PREDICT-IV，第三 次和第四次项目周报（Project Periodic Report)，2012年6月30日）。应注意，通过破 坏器官获得的原生细胞通常显示一定程度的损伤响应。我们观察到VM、NGAL和KM-I均 已经以相对高的水平在未处理的对照细胞中表达（图5)，这与VM情况中的先前结果一致 (46)。这可能能够解释在用肾毒素处理后缺乏上调或仅中度上调的现象。就测试的所有标 志物基因而言，IL-6和IL-8在未处理的HPTC中的表达水平最低，并且均一致地〈0. 1%的 GATOH表达。
[0122] 采用41种化合物分析预测性能：接下来，我们测定了对41种成熟表征的和化学品 的响应。本文所用的这41种化合物中的大多数是常规且广泛应用于临床实践中的药物。一 些化合物，如CdCl2或林丹，是成熟表征的环境毒素，并且对于所有化合物而言，均有可获得 的大量人类和动物体内及体外数据。作为起始点，我们从根据化合物的人体肾毒性及其对 肾和肾单位的不同部分的作用从所述化合物分类的公开列表中选择化合物（2, 3, 18, 19)。 然后，我们进行了广泛的文献检索（PubMed)，并且采用Google和ChemIDplus高级数据库来 进一步获得关于各个所选化合物的信息，以确认其分类。
[0123] 22种化合物被归为已知直接损伤PT的肾毒素（组1，表1，化合物1-22 ;除了 PT 特异性损伤以外，这些药物中的一些对肾具有不同阴性效果）。此外，这41种化合物包括 不直接损伤PT且对肾具有其它作用的11种肾毒素（组2,表1，化合物23-33)。此外，包 括8种非肾毒性药物（组3,表1，化合物34-41)。该试验采用源自不同供者的三个批次的 HPTC并且终点是通过qPCR测定的IL-6和IL-8的表达。为比较，所有实验均采用HK-2和 LLC-PKl 细胞（表 1)。
[0124] 在以融合密度培养细胞3天后，进行16小时的药物接触。初始时，我们检测了覆盖 5个量级的0. 01 μ g/ml~1000 μ g/ml的宽浓度范围。由于通常在两个最低浓度观察不到 药物诱导的变化（相较于对照），我们缩小了范围并且在所有情况中检测1 μ g/ml、10 μ g/ ml、100μg/ml和1000 μg/ml的浓度。因此，在所有实验中应用最宽的有用浓度范围，其中 低于下限的浓度缺乏药物诱导的变化，而高于上限的浓度则影响许多化合物的溶解性。所 有结果对载体对照标准化，并且以IL-6和IL-8表达的倍数变化表示。
[0125] 采用HPTC和选自各组的三种药物获得的剂量响应曲线示于图2。对于各细胞批 次/类型和各浓度下的各药物而言，IL-6和IL-8表达水平的详细结果列于表9-18 (图 17-26)。就各药物和细胞批次/类型以测试范围内的任何给定药物浓度测定的IL-6和IL-8 表达的最高水平于表9-18中突出显示。这些最高表达水平汇总于表1和2。结果显示不 同药物对IL-6和IL-8的表达具有不同作用，并且一些药物诱导两种标志物基因，而另一些 药物仅诱导一种标志物基因或不诱导标志物基因（图2)。在接触PT特异性肾毒素之后，通 常有至少一种标志物基因的表达显著升高（组1，表1和2(图9和10)，图2)，而在接触组 2和3的药物之后，所有浓度下的基因表达水平通常保持在低水平（表1和2,图2)。通过 ELISA评估IL-6和IL-8的分泌时，获得总体相当的结果（数据未显示）。然而，所用药物 中的许多抑制蛋白质合成，因而qPCR数据更为可靠。
[0126] 为了将采用特定药物和细胞类型/批次获得的结果归为阳性或阴性，测定了最高 表达水平（平均值；表1和2)是否等于或高于阈值。若所述标志物（IL-6和IL-8)中有至 少一种的基因表达的最高增幅等于或高于阈值（表1和2)，即将该药物归为阳性并预测为 PT特异性肾毒素。由于并不清楚何种阈值最为合适，该分析就0. 3~4. 0范围的阈值水平 进行研宄。
[0127] 说明数据处理的示例示于表3和4。这两个表格均显示由HPTC 1获得的相同数据 集。该数据集与表2中的HPTC 1数据集相同，并且显示IL-6和IL-8的最高表达水平。对 该数据集分别应用2. O的阈值（表3(图11))或3. 5的阈值（表4(图12))。若至少一种 标志物基因的表达水平等于或高于阈值，则将测试结果归为阳性，且归类示于表3和4。基 于这些结果，计算灵敏度（组1化合物的阳性测试结果数量（TP)/22种组1化合物总数） 和特异度（组2和3化合物的阴性测试结果数量（TN)/19种组2和3化合物总数）。
[0128] 通过该方式，以7个不同阈值水平计算各细胞类型和批次的灵敏度和特异度。结 果汇总于表5 (图13)，并且以图表形式示于图3。此外，图3