色谱柱中或与其相关的改进的制作方法
【专利说明】色谱柱中或与其相关的改进 发明领域
[0001] 本发明涉及液相色谱法的领域。
[0002] 发明背景
[0003] 液相（LC)色谱柱已经得到广泛地发展并且常规地用于分析型和制备型色谱法两 者中。在液相色谱柱中分离包含多种组分的混合物的样品是通过以下方式实现的：将处于 液体流动相的样品输送通过固定相，从而导致该样品分离成其多种组分，这是由于每种组 分在流动相与固定相之间的不同分配（即，这些组分具有不同的分配系数）。在液相色谱法 中，固定相典型地处于在柱（通常管状柱）内填充的颗粒床的形式。本发明涉及此种所谓 的填充柱，其中该柱介质包含填充颗粒。
[0004] 二氧化硅颗粒通常用作固定相床，尽管可以使用其他材料。无孔材料具有低样品 容量。因此，通常使用多孔颗粒，其含有孔网络以增加固定相的表面积并且因此改进分离容 量。较大的多孔颗粒倾向于具有对于样品的更长传质距离，这导致与用较小的多孔颗粒相 比更慢的分离和更宽的保留时间峰。因此，减小多孔颗粒的尺寸以便改进分离的动力学和 分辨率已成为趋势。这对于分离大生物分子（如例如蛋白质）是重要的。然而，使用较小 多孔颗粒的结果是增加的流动阻力并且因此需要更高的操作压力来递送所需求的流动。更 高的压力增加了仪器装备的成本和复杂性。
[0005] 对于上述全多孔型颗粒（其中这些孔延伸穿过整个颗粒的本体）的一种替代方案 已经使用所谓的熔融核颗粒，这些熔融核颗粒有时也被称为表面多孔型颗粒。这些是具有 无孔核（也被称为熔融或实心核）的颗粒并且仅在包围该核的外部层或区域（也被称为 壳）中是多孔的，即，它们仅在表面处是多孔的，而不是遍及这些颗粒的本体。这些颗粒具 有小多孔颗粒的一些优点，例如由外部多孔壳提供的短传质距离以及因此高色谱效率，但 由于该实心核使得能够使用较低的操作压力，总体粒径更大。由于更有效地分类更大、更重 的颗粒的能力，熔融核颗粒还提供了具有比多孔颗粒更窄的粒径分布的可能性。
[0006] 尽管使用熔融核颗粒已改进了可以用较低压力递送的柱效率，然而仍存在需要来 在保持良好的柱效率的同时再进一步减少操作压力。
[0007] 针对此背景，做出了本发明。
[0008] 发明概述
[0009] 根据本发明的一个方面，提供了一种含有填充颗粒的床的色谱柱，其中这些填充 颗粒包含熔融核颗粒并且这些填充颗粒的粒径沿着该柱变化。
[0010] 根据本发明的另一个方面，提供了一种色谱方法，该方法包括使含有待分离的样 品的流动相流动通过含有填充颗粒的床的色谱柱，其中这些填充颗粒包含熔融核颗粒并且 这些填充颗粒的粒径沿着该柱变化。
[0011] 优选地，该床的颗粒是根据它们的粒径安排在该柱中，如以下进一步详细描述的， 最优选按从入口端至出口端渐增的粒径的顺序。该颗粒的床可以包含如以下进一步详细描 述的多个床区段。在此种实施例中，优选地至少一个床区段、更优选地每个床区段具有与其 他一个或多个床区段不同的平均粒径（从在那个区段中的颗粒计算出的）。具有不同粒径 的床区段是优选按从该柱的入口至出口渐增的粒径的顺序安排的。较小颗粒具有比较大颗 粒更大的每单位体积的表面积，这样使得将样品装载到在该柱的入口端处的较小颗粒上需 要更低的柱体积并且因此减小样品塞尺寸。然后在该柱中的其余颗粒作用在这个小样品塞 上并且维持柱效率。相反地，如果使用随机粒径混合物，那么将样品装载到这些颗粒上将需 要更大的柱体积并且因此样品塞尺寸将更大。然后在该柱中的其余颗粒将作用在这个更宽 的样品塞上。
[0012] 根据本发明的又另一个方面，提供了一种色谱柱，该柱含有填充颗粒的床，这些填 充颗粒包含熔融核颗粒，其中该床包含多个床区段，并且每个床区段具有从在那个区段中 的颗粒计算出的平均粒径，并且存在至少两个不同平均粒径的床区段，其中每个床的颗粒 通过隔离物与相邻床的颗粒分开，该隔离物是液体可渗透的以允许通过流动相的流。该隔 离物实质上防止来自一个区段的颗粒与相邻区段的颗粒混合。优选地，每个床区段具有与 其他一个或多个区段不同的平均粒径。
[0013] 优选地，这些床区段是根据它们的平均粒径安排的，最优选地按从入口端至出口 端渐增的平均粒径的顺序。因此，最优选地，具有最小粒径的床区段被安排在入口端并且具 有最大粒径的床区段被安排在出口端，任何另外的床区段优选按从入口至出口渐增的粒径 的顺序被安排在中间。
[0014] 在本发明的某些优选实施例中，该多个床区段被安排在该柱的多个单独的隔室 中，g卩，每个床区段安排在该柱的一个单独的隔室中。在一个优选的实施例中，该柱包含可 串联地连接在一起的多个子柱。当被连接在一起时，该系列子柱（相对短）提供该柱（相 对长）。因此这些床区段可以各自被提供在一个对应的子柱中。螺纹配件、以及推入式配件 是典型地在这些子柱之间的连接方式。使用子柱组件构型，与其他一个或多个床区段分开 地并且独立于其他一个或多个床区段，这些床区段可以各自用所希望直径的填充颗粒来制 备。这些床区段可以随后通过串联连接这些子柱而进行串联连接。这些子柱可以具有相同 的长度，或者一个或多个子柱可以具有与其他一个或多个柱不同的长度。
[0015] 这些床区段（以及因此含有这些床区段的隔室、或子柱）沿着该柱的长度串联地 定位，即这样使得流动相流动通过一个第一床区段，然后通过一个第二床区段并且然后任 选地通过任何另外的一个或多个床区段。这些床区段是自含式的，这样使得一个床区段的 颗粒不能与相邻床区段的颗粒混合，从而将这些床区段分开。一种物理限制（隔离物）用 于保持相邻的床区段分开并且改进该柱床的稳定性。使用液体-多孔隔离物或屏障作为在 相邻的床区段之间的隔离物是一种用于确保这些床区段的自含性的手段（即，允许液体通 过但不允许填充颗粒通过的隔离物）。滤芯（frit)(即，多孔滤芯）是用于此目的的一种合 适的隔离物，如钢滤芯。其他隔离物可以是多孔网、或多孔单块、或多孔过滤器。
[0016] 床区段（以及因此含有这些床区段的隔室、或子柱）的数目可以是2或更大的任 何合适数目，优选3或更大。例如，可以使用2、3、4、5、6、7、8、9或10个床区段。然而，本发 明不限于此类具体实施例并且可以使用更高数目的隔室。这些床区段可以具有相等或不等 的长度。在一些实施例中，这些床区段中的至少一些具有彼此不同的长度。
[0017] 每个隔室可以作为单个柱的一个单独的分隔区段被提供，即，每个床区段可以被 提供在单个柱的一个单独的分隔区段中。优选地，然而，每个隔室作为一个单独的柱部分 (子柱）被提供，即，每个床区段被提供在一个单独的柱部分（子柱）中，并且这些柱部分 (子柱）串联地连接在一起。每个柱部分（子柱）可以优选通过螺纹配合、或通过推入配合 连接到相邻的部分（子柱）。
[0018] 在此术语熔融核颗粒是指一种表面多孔型颗粒，其中一个实质上无孔的核被一个 多孔的外部区域或壳包围。
[0019] 优选地，这些填充颗粒以沿着该柱的粒径梯度进行安排。特别地，优选具有一个粒 径梯度，其中这些粒径从该柱的入口端到该柱的出口端增加。
[0020] 这些粒径可以沿着该柱以平滑梯度或阶跃梯度变化。平滑梯度可以是沿着该柱的 一个恒定梯度（即，同一梯度）、或沿着该柱的非恒定梯度（即，具有不同的梯度）。该粒径 梯度最优选从该入口端至该出口端是正的（即，粒径渐增）。分阶梯度可以包含沿着该柱的 粒径上的任何数目η的阶跃变化，其中η是一或更大的整数值。因此，可以看到最简单的实 施例是具有沿着该柱的粒径上的一个阶跃变化，具有例如：一个第一级别的颗粒具有位于 最靠近该柱的入口端的小直径，并且一个第二级别的颗粒具有位于最靠近该柱的出口端的 大直径。在此背景下，术语小和大是指这些颗粒相对于彼此的直径。
[0021] 随着沿着该柱的长度的距离而变化的粒径是指该颗粒的总（即外部）直径。它是 指在沿着该柱的给定距离处包含在穿过该柱的横截面中的粒径的平均值。
[0022] 在一些实施例中，除了这些熔融核颗粒之外，一定比例的填充颗粒可以包含全多 孔型颗粒。在此类实施例中，为全多孔型颗粒的填充颗粒的比例优选是少数的比例。希望 地，当存在时，此类全多孔型颗粒