含cd54表达之报告系统之免疫细胞的应用以及经克隆之新颖细胞的制作方法
【专利说明】含CD54表达之报告系统之免疫细胞的应用以及经克隆之 新颖细胞 发明领域
[0001] 本发明关于含⑶54表达之报告系统之免疫细胞的应用，且特别关于将此含⑶54 表达之报告系统之免疫细胞应用于确认免疫调节物质的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 0)54(分化簇 54(Cluster of Difffeentiation 54))(也已知为细胞间黏附分 子-I (Intercellular Adhesion Molecule 1，ICAM_1)，其为于人类体中由 ICAMl 基因所编 码出之蛋白质。此基因编码出通常表达于内皮细胞（endothelial cells)与免疫系统之细 胞上的细胞表面糖蛋白（glycoprotein)。0)54与⑶I la/Q)18型（type)，或⑶llb/Q)18型 之整联蛋白（integrins)结合，且也被鼻病毒（rhinovirus)利用为一受体（receptor)。目 前已知⑶54为免疫反应,特别是过敏反应的一生物标记。
[0004] 免疫反应在许多疾病皆扮演重要的角色，例如发炎反应，皮肤敏感性等等，因此许 多药物皆针对调节免疫系统进行开发。但是免疫系统所涉及的生物分子及细胞种类繁多， 因此常需要以活体动物实验以进行实验评估，而造成时间及成本增加。虽然目前已有许多 的细胞实验模型可以进行调节免疫反应的测试，然而，其在分析上常需要以ELISA或流式 细胞仪来进行实验，也较平常生物实验复杂。
[0005] 又，致敏性是化妆品、各种化学品、农产品、环境毒物、工业制品等产品上市前的重 要安全性评估项目。顺应动物实验伦理及减量的趋势，欧美日各国的研究机构和相关企业 公司均投入相当大的资源于替代性动物实验方法的开发，但目前在国际上仍未出现公认可 以取代动物实验的替代方式。
[0006] 因此，目前亟需发展不须动物实验之确认免疫调节物质或致敏物质的新方法以适 合高通量测试使用。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种确认免疫调节物质的方法，包括：(a)提供待测物与免疫细胞，其 中该免疫细胞包括CD54表达之报告系统，而该CD54表达之报告系统，包括：CD54基因之启 动子；以及报告基因，与该CD54基因之启动子连接，用以报告该CD54基因之启动子的表达； (b)以该待测物处理该免疫细胞；以及（c)测定经该待测物处理之该免疫细胞所产生之该 报告基因的产物表达以判定该待测物是否有免疫调节作用。
[0008] 本发明也提供一种确认皮肤致敏物质的方法，包括：(a)提供待测物与免疫细胞， 其中该免疫细胞包括CD54表达之报告系统，而该CD54表达之报告系统，包括：CD54基因之 启动子；以及报告基因，与该CD54基因之启动子连接，用以报告该CD54基因之启动子的表 达；(b)以该待测物处理该免疫细胞；以及（c)测定经该待测物处理之该免疫细胞所产生之 该报告基因的产物表达以判定该待测物是否为皮肤致敏物质。
[0009] 本发明更提供一种经克隆之新颖细胞，其系于2014年11月12日保藏于德国微生 物和细胞培养物保藏中心，保藏编号为DSM ACC3257。
[0010] 因此本发明提供了不须动物实验之确认免疫调节物质或皮肤致敏物质的新方法 以适合高通量测试使用，开发出替代动物实验的方法，符合相关动物实验伦理及减量的趋 势。
【附图说明】
[0011] 图1显不本发明一实施例之⑶54-启动子mLuc表达系统。
[0012] 图2显示本发明一实施例之判定待测物质是否为皮肤致敏物的流程。以及
[0013] 图3显示本发明一实施例之判定待测物质是否为抗发炎物质的流程。
[0014] 发明详述
[0015] 在本发明一实施方案中，本发明提供一种确认免疫调节物质的方法。本发明之确 认免疫调节物质的方法，可包括，但不限于下列所述步骤。
[0016] 首先，提供待测物与包括⑶54表达之报告系统的免疫细胞。
[0017] 上述待测物之例子可包括，例如，化妆品、药物、化学物、天然物之萃取物等，但不 限于此。而上述免疫细胞之来源的例子则可包括，但不限于THP-I细胞、U937细胞、MUTZ-3 细胞等。在一实施例中，而上述免疫细胞之来源为THP-I细胞。
[0018] 上述免疫细胞之⑶54表达之报告系统，可包括，但不限于，⑶54基因之启动子 (0)54 promoter)与报告基因 （reporter gene),其中上述报告基因与上述⑶54基因之启 动子连接，用以报告CD54基因之启动子的表达。
[0019] 在一实施例中，上述⑶54基因之启动子之序列可包括序列辨识号：1之序列，而在 另一实施例中，上述CD54基因之启动子之序列可为序列辨识号：1之序列。
[0020] 再者，上述报告基因的例子可包括，但不限于长腹水蚤科萤光素酶（Metridia Iuciferase)基因、萤火虫萤光素酶（firefly Iuciferase)基因、绿色突光蛋白质（green fluorescent protein，GFP)基因 、β -葡萄糖醒酸苷酶（β-glucuronidase)基因等。在一 实施例中，上述报告基因为长腹水蚤科萤光素酶基因。长腹水蚤科萤光素酶基因之产物会 被细胞直接分泌至培养液，因此测定其表达（例如，活性）时，可直接将培养基进行冷光分 析，不须将细胞打破，具有节省分析时间之优点。
[0021] 在一实施例中，上述⑶54基因之启动子之序列为序列辨识号：1之序列，而上述免 疫细胞之来源为THP-I细胞。在另一实施例中，上述CD54基因之启动子之序列为序列辨识 号：1之序列，而上述报告基因为长腹水蚤科萤光素酶基因。又，在另一实施例中，上述CD54 基因之启动子之序列为序列辨识号：1之序列，上述免疫细胞之来源为THP-I细胞，且上述 报告基因为长腹水蚤科萤光素酶基因。
[0022] 于本发明之确认免疫调节物质的方法的一实施例中，包含CD54基因之启动子与 报告基因之前述CD54表达报告系统的序列可包括序列辨识号：2之序列。在一特定实施 例中，前述CD54表达报告系统的序列可为序列辨识号：2之序列，即CD54表达报告系统为 ⑶54基因之启动子-长腹水蚤科萤光素酶基因（⑶54 promoter-Metridia Luc)之形式。 而于此特定实施例中，所使用之包括CD54表达之报告系统的免疫细胞，可为藉由将具有序 列辨识号：2之序列的病毒载体感染进入THP-I细胞所获得的细胞，而此细胞可以是命名为 ITRI-54M之细胞，其于2014年11月12日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏 编号为 DSM ACC3257。
[0023] 接着，以上述待测物处理上述包括⑶54表达之报告系统的免疫细胞。在一实施例 中，处理时间为约1-2天，但不限于此。又，在一实施例中，在以上述待测物处理上述包括 CD54表达之报告系统的免疫细胞之前，可先将待测物对此免疫系胞进行细胞毒性分析，测 定出此待测物对此细胞之半生长抑制浓度，并藉此获得处理浓度。
[0024] 然后，在以上述待测物处理上述包括⑶54表达之报告系统的免疫细胞之后，测定 经上述待测物处理之上述免疫细胞所产生之报告基因的产物表达以判定上述待测物是否 有免疫调节作用。
[0025] 于本发明之确认免疫调节物质的方法的一实施例中，在测定经上述待测物处理之 免疫细胞所产生之报告基因的产物表达以判定上述待测物是否有免疫调节作用的步骤中， 系将经待测物处理之免疫细胞所产生之报告基因的产物表达与未经待测物处理之上述免 疫细胞之报告基因产物的表达作比较，以判定待测物是否具有免疫调节作用。若经待测物 处理之免疫细胞所产生之报告基因的产物表达高于未经待测物处理之免疫细胞之报告基 因产物的表达，则判定此待测物具有免疫调节作用，为免疫调节物质。
[0026] 在于本发明之确认免疫调节物质的方法的另一实施例中，在以待测物处理包括 CD54表达之报告系统的免疫细胞的步骤中，进一步包含添加免疫诱发物质，以使免疫细胞 产生免疫反应。于此实施例中，在测定经待测物处理之免疫细胞所产生之报告基因的产物 表达以判定上述待测物是否有免疫调节作用的步骤中，系将经待测物与免疫诱发物质处理 之免疫细胞所产生之报告基因的产物表达与仅经免疫诱发物质处理之免疫细胞之报告基 因产物的表达作比较，以判定待测物是否有免疫调节作用。若经待测物与免疫诱发物质处 理之免疫细胞所产生之报告基因的产物表达低于仅经免疫诱发物质处理之免疫细胞之报 告