基因产物的表达，则判定此待测物具有免疫抑制作用，为免疫抑制物质。
[0027] 上述免疫反应诱发物质可包括任何可引起免疫反应的物质，例如脂多糖体 (lipopolysaccharide，LPS)、乙酸豆塞外佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA)、刀豆 素 A(concanavalin A，Con A)等，但不限于此。
[0028] 在一实施例中，于本发明之确认免疫调节物质的方法中所使用之免疫反应诱发物 质可为脂多糖体、乙酸豆塞外佛波酯或刀豆素 A，其为致发炎物质。
[0029] 于上述实施例中，在测定经待测物处理之免疫细胞所产生之报告基因的产物表达 以判定上述待测物是否有免疫调节作用的步骤中，判定待测物是否有免疫调节作用，可包 含判定待测物是否具抗发炎作用，以判定此待测物是否抗发炎物质。
[0030] 测定上述免疫细胞所产生之报告基因的产物表达的方式，根据报告基因之产物的 性质而定（例如可测其活性）。而不同报告基因的产物表达的测定方式，为该技术领域中具 有通常知识者所熟知。例如，由于长腹水蚤科萤光素酶基因之产物会被细胞直接分泌至培 养液，因此可直接将培养细胞之培养基进行冷光分析来测定长腹水蚤科萤光素酶基因之产 物表达。
[0031] 在本发明另一实施方案中，本发明还提供一种确认皮肤致敏物质的方法，而本发 明之确认皮肤致敏物质的方法，可包括下列所述步骤，但不限于此。
[0032] 提供待测物与包括⑶54表达之报告系统的免疫细胞。
[0033] 待测物可为任何物质，并无特别限制。上述待测物之例子可包括，例如，化妆品、药 物、化学物、天然物之萃取物等，但不限于。而上述免疫细胞之来源的例子则可包括，THP-I 细胞、U937细胞、MUTZ-3细胞等，但不限于此。在一实施例中，上述免疫细胞之来源为THP-I 细胞。
[0034] 此外，上述免疫细胞所包含之⑶54表达之报告系统，可包括⑶54基因之启动子与 报告基因，但不限于此，其中上述报告基因与上述CD54基因之启动子连接，用以报告CD54 基因之启动子的表达。
[0035] 在一实施例中，上述⑶54基因之启动子之序列可包括序列辨识号：1之序列，而在 另一实施例中，上述CD54基因之启动子之序列可为序列辨识号：1之序列。
[0036] 而相似于前述本发明之确认免疫调节物质的方法中所使用之报告基因，本发明之 确认皮肤致敏物质的方法中之报告基因的例子可包括，但不限于长腹水蚤科萤光素酶基 因、萤火虫萤光素酶基因、绿色荧光蛋白质基因、β-葡萄糖醛酸苷酶基因等。在一实施例 中，上述报告基因为长腹水蚤科萤光素酶基因。长腹水蚤科萤光素酶基因之产物会被细胞 直接分泌至培养液，因此测定其表达（例如，活性）时，可直接将培养基进行冷光分析，不须 将细胞打破，具有节省分析时间之优点。
[0037] 在一实施例中，上述⑶54基因之启动子之序列为序列辨识号：1之序列，而上述免 疫细胞之来源为THP-I细胞。在另一实施例中，上述CD54基因之启动子之序列为序列辨识 号：1之序列，而上述报告基因为长腹水蚤科萤光素酶基因。又，在另一实施例中，上述CD54 基因之启动子之序列为序列辨识号：1之序列，上述免疫细胞之来源为THP-I细胞，且上述 报告基因为长腹水蚤科萤光素酶基因。
[0038] 于本发明之确认皮肤致敏物质的方法的一实施例中，包含CD54基因之启动子与 报告基因之前述CD54表达报告系统的序列可包括序列辨识号：2之序列。在一特定实施 例中，前述CD54表达报告系统的序列可为序列辨识号：2之序列，即CD54表达报告系统为 ⑶54基因之启动子-长腹水蚤科萤光素酶基因（⑶54 promoter-Metridia Luc)之形式。 而于此特定实施例中，所使用之包括CD54表达之报告系统的免疫细胞，可为藉由将具有序 列辨识号：2之序列的病毒载体感染进入THP-I细胞所获得的细胞，而此细胞可以是命名为 ITRI-54M之细胞，其于2014年11月12日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏 编号为 DSM ACC3257。
[0039] 接着，以上述待测物处理上述包括⑶54表达之报告系统的免疫细胞。在一实施例 中，处理时间为约1-2天，但不限于此。
[0040] 又，在一实施例中，在以上述待测物处理上述包括⑶54表达之报告系统的免疫细 胞之前，可先将待测物对此免疫系胞进行细胞毒性分析，测定出此待测物对此细胞之半生 长抑制浓度，并藉此获得处理浓度。
[0041] 最后，在以上述待测物处理上述包括⑶54表达之报告系统的免疫细胞之后，测定 经上述待测物处理之上述免疫细胞所产生之报告基因的产物表达以判定上述待测物是否 为皮肤致敏物质。
[0042] 于一实施例中，在测定经上述待测物处理之上述免疫细胞所产生之报告基因的产 物表达以判定上述待测物是否为皮肤致敏物质的步骤中，系将经上述待测物处理之上述免 疫细胞所产生之报告基因的产物表达与未经上述待测物处理之免疫细胞之报告基因产物 的表达作比较，以判定上述待测物是否具有免疫调节作用。若经待测物处理之免疫细胞所 产生之报告基因的产物表达高于未经待测物处理之免疫细胞之报告基因产物的表达,则判 定此待测物为皮肤致敏物质。
[0043] 测定上述免疫细胞所产生之报告基因的产物表达的方式，根据报告基因之产物的 性质而定（例如可测其活性）。而不同报告基因的产物表达的测定方式，为该技术领域中具 有通常知识者所熟知。例如，由于长腹水蚤科萤光素酶基因之产物会被细胞直接分泌至培 养液，因此可直接将培养细胞之培养基进行冷光分析来测定长腹水蚤科萤光素酶基因之产 物表达。
[0044] 此外，在本发明之又另一实施方案中，本发明更提供一种经克隆之新颖细胞，命名 为ITRI-54M，其系于2014年11月12日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏编 号为 DSM ACC3257。。
[0045] 此细胞具有⑶54基因之启动子-长腹水蚤科萤光素酶基因（CD54 promoter-Metridia Luc)之形式的⑶54表达报告系统，而0)54表达报告系统之序列为序 列辨识号：2之序列。 实施例
[0046] 实施例1
[0047] 建立 ITRI-MM 细胞
[0048] 依照 LVX-MetLuc (Clontech，PT4422-5)质粒的制造商操作指南，将 LVX-MetLuc 质粒以BstB I及BamH I限制酶处理，以使CD54启动子序列（序列辨识号：1)转移 至LVX-MetLuc质粒中，以形成⑶54-promoter mLuc表达系统（第1图），其中于此 表达系统中，CD54启动子-mLuc之序列为序列辨识号：2之序列。之后将所形成之 CD54-promoter mLuc 表达系统利用 Lenti-XTMReady-T〇-Glow? Secreted Luciferase Reporter System(Clontech，631746)转染至 293FT 细胞中以产生带有 CD54_mLuc 的慢病 毒（Lentivirus)。接着以此病毒感染THP-I细胞。THP-I细胞系培养于THP-I培养液，其 成分为 RPMI 培养液（GIBC0, 31800)，内含 10% FBS (GIBC0,10437)，4. 5g/L 葡萄糖（Sigma， G7021)，IOmM HEPES(Sigma，H4034)、Ix 青霉素 （penicillin)与链霉素 （streptomycin) (Biowest，LO〇22)、ImM 丙酮酸钠 （sodium pyruvate) (Biowest，L〇642)、0.〇5mM 2_ 疏基乙 醇（2-mercaptoethanol，2-ME)(GIBC0,21985_023)。
[0049] 然后，以 0· 5 ~I μ g/mL 噪呤霉素（puromycin) (Invivogen，ant-pr-l)来对 THP-I细胞进行筛选。筛选2周之后，再加入IOOuL带有细胞之培养液（浓度：5细胞/ mL)至96孔盘（Corning Incorporation C0STAR，3599)中，待细胞数增加之后，将细胞逐 步利用 24 孔盘（Corning Incorporation C0STAR，35I6)、6 孔盘（Corning Incorporation C0STAR，3524)及 T25 烧瓶（flask)(Corning Incorporation C0STAR，430639)放 大。并将各细胞株以已知的致敏物（86118；[1^261')1-氯-2,4-二硝基苯（1-(3