一种染色体r显带的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，特别涉及一种医学检验领域中用于染色体核型分析R显带的制备方法。
【背景技术】
[0002]染色体核型分析是将待测的细胞的染色体按照该生物固有的染色体形态特征和规定，进行配对、编号和分组，并进行形态分析的过程。染色体核型分析属于形态学范畴，通过人工分析，找出染色体在宏观的形态学上的异常，比如缺失增加或者异位，以此为临床提供诊断依据。根据不同的制备流程，染色体显带方法分为Q带、G带、R带、C带、T带、N带，其中最为常用的R显带，其次是G显带。R显带的机理目前并不完全了解，在高温(80?900C )的处理下诱发了染色体蛋白质的变化。Comings (1978)认为在高温下G带的中AT丰富区变性而显出特别亲染，但在R带中正恰相反，AT丰富区却并不显出亲染作用，故而显出浅染带区，电镜的观察进一步表明了这些带和间带区域的差异主要在于电子密度的不同，R带所显示之深浅带纹区域正同G带之带纹区域相反，即G带深染区，R带为浅染区，反之亦然。由于这种技术所显示深浅带纹正好与G带相反，故称逆相G带(Reverse G-band)，故又称R带。在G带染色体的两末端都不显示深染，而在R带中则被染上深色，因此R带有利测定染色体长度以末端区域结构的变化。但是根据发明人的实验反推，这个机理并不正确。发明人认为，R显带液诱发的并不是染色体中蛋白质的变化，而是蛋白质降解产物的变化，也就是说显带液是磷酸盐溶液，显带液和无机物发生变化。无机物的多少取决于染色体老化的程度，老化程度越高，无机物的比例越大，消化就越充分，显带时间就越短，所以才有公认的R显带时间与老化程度成反比。而G显带采用胰酶消化，酶消化的对象是蛋白质，所以标本越新鲜，蛋白质比例就越高，就越好消化，消化时间就越短，所以才有公认的G显带老化时间与显带时间成正比。这和AT丰富区没有直接关系。
[0003]目前染色体核型分析R显带制备常用的流程为，抽取骨髓，根据不同的细胞浓度接种培养，放入溫箱16-24小时，第二天收获，先加秋水仙碱，一小时后倒入离心管，离心去上清，加低渗液，溫箱内低渗40分钟，然后预固定，再离心再固定，反复两次，细胞核沉淀后，吸取固定液，留取细胞悬液进行滴片。传统滴片方法为，左手持载玻片，右手持一次性塑料滴管吸取细胞悬液，于40厘米高空处向载玻片头体尾三处各滴一滴，然后载玻片在酒精灯上方过火，过火时尽量使载玻片上的固定液(由甲醇与乙酸3:1构成)燃烧，但同时不能够使载玻片在火焰上方烘烤过热，过火过度与不足都会导致效果不好。载玻片着火干燥后，放在室温下过夜，第三天进行显带。R显带液由磷酸盐溶液构成，PH值为6.3-6.5之间，显带液倒入瓷缸中，在水浴箱内升温至87.3度，放入玻璃片，75至80分钟时取出，流水冲去显带液，再进行吉姆萨染液染色10-15分钟。传统方法有三处不足，第一，高位滴片不好把握，头体尾三个位置不可能滴的非常准确的，可能有重叠部分，甚至会滴到片外，造成浪费，很难标准化。第二，因为过火导致片子老化程度不固定，过火的火候无法掌握，要么过火过度要么不足，很难标准化。第三，高位滴片和过火的流程中每次只能滴一张，而每个标本需要滴两张，在标本量很大的情况下，耗时较长。第四，片子放在室温下过夜，会受季节气候的影响，造成染色体老化程度不固定，因为染色体老化程度与显带时间成反比，老化不固定，显带时间就无法固定，导致分裂像质量不稳定。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种标准化、分散程度高，分裂相的质量更好，带型更加清晰易分析的染色体R显带的制备方法。
[0005]本发明采用的技术方案为:
[0006]一种染色体R显带的制备方法，包括如下步骤:
[0007]将经过低渗、固定的骨髓细胞悬液进行划片，划片的操作方法为，左手持玻片倾斜，右手持滴管吸取细胞悬液后，沿着玻片上缘从左向右缓慢划去，边划边挤出悬液，使之均匀流下铺满全片；
[0008]将玻片放入恒温箱中，控制温度在37°C，16h后取出；进行显带，染色。
[0009]优选地，划片的实验室环境保持在20-60%的湿度，温度保持在24_26°C。
[0010]优选地，所述显带步骤中:R显带液为Earles平衡盐溶液，pH值控制为6.40恒定不变，时间为88分钟，温度保持87.3°C不变。
[0011]优选地，所述染色步骤中，染液为吉姆萨染液，用缓冲液进行稀释得吉姆萨工作液，缓冲液(PBS缓冲液):吉姆萨染液体积比为10:1，用吉姆萨工作液染色12分钟。
[0012](划片的实验室环境湿度保持20- 60%的湿度，湿度如降低至20%以下，会影响分裂相分散度，使用加湿器即可调整，温度保持在24-26?，采用中央空调即可控制。)
[0013]优选地，所述载玻片为无油玻璃片。(载玻片应为无油的优质玻璃片，玻璃片上有杂质会影响染色体核型清晰程度。)
[0014]本发明中恒温箱为普通电热恒溫箱。不选择隔水式恒温箱，因为隔水式没有干燥吹气功能，会使片子老化程度不足。
[0015]所述的低渗、固定的骨髓细胞悬液为采用常规的工艺制备得到，如抽取骨髓，根据不同的细胞浓度接种培养，放入恒温箱16-24小时，第二天收获，先加秋水仙碱，一小时后倒入离心管，离心去上清，加低渗液，恒温箱内低渗40分钟，然后预固定，再离心再固定，反复两次，细胞核沉淀后，吸取固定液，留取细胞悬液进行划片。
[0016]本发明不经过火，直接放在平板上晾干，使固定液在一定湿度和温度的环境下自然挥发。传统理论认为，过火有助于染色体的分裂相的分散，但是最新研宄显示染色体分裂相的分散与固定液的分散时间有关。挥发时间越长，微观环境下的染色体就越容易扩散。高位滴片能够使液体的水滴飞溅的范围