借助可磁化珠粒检测分析物并且确定分析物浓度的制作方法
【专利说明】借助可磁化珠粒检测分析物并且确定分析物浓度
[0001 ] 本发明涉及用于检测样本中的分析物的方法、试剂和装置。
[0002] 有许多不同的用于检测分析物、如用于医学诊断的临床参数的方法，在其中借助 适合的方法、尤其是光学和/或电化学的方法确定样本中的分析物的存在和/或浓度。
[0003] 本发明所基于的任务在于提供一种新型并且简单的用于检测分析物的方法以及 适用于此的试剂和装置。
[0004] 在本发明中，借助可磁化珠粒确定待检测的分析物的存在或浓度，所述珠粒涂有 结合分子，从而珠粒可根据样本中的分析物的存在和/或浓度发生聚合或者说交联。磁性 检测所述聚合或交联的程度，由此可定性和/或定量地确定样本中存在的分析物。
[0005] 本发明的第一个方面涉及一种用于检测样本中的分析物的方法，包括下述步骤：
[0006] (a)使样本与可磁化珠粒接触，所述珠粒涂有结合分子，从而可磁化珠粒根据样本 中的分析物的存在和/或浓度实现聚合，并且
[0007] (b)通过磁性检测确定可磁化珠粒的聚合程度。
[0008] 本发明的另一方面涉及一种用于检测样本中的分析物的试剂，该试剂包括一个或 多个种类（species)的可磁化珠粒，所述珠粒涂有结合分子，从而可磁化珠粒能够根据样 本中的分析物的存在和/或浓度聚合。
[0009] 所述试剂可用于磁性检测分析物的方法、尤其是如上所述的方法中。
[0010] 本发明的另一方面涉及一种用于检测样本中的分析物的装置，该装置包括：
[0011] (a)试验井、
[0012] (b)用于在试验井中产生磁场的磁铁和
[0013] (C)磁场传感器，用于测量试验井中的磁场的随时间的变化。
[0014] 所述装置可用于磁性检测分析物的方法、尤其是如上所述的方法中。
[0015] 本发明涉及样本中的分析物的检测。分析物原则上可以是任一可通过结合到一种 或多种特异性结合配偶体（Bindepartner)上来检测的物质。分析物例如是蛋白质、如抗 体、受体、受体配体、酶等、核酸、如DNA或RNA、激素、信号发射器、代谢物、药物、毒品或病原 体、如病毒或细菌、或任何其它类型的可检测的物质。该方法优选用于检测抗体、如针对病 原体的抗体、自身免疫性抗原、代谢物等。
[0016] 样本优选是生物来源、如体液样本、如血液、血清、血浆、尿液、唾液、脑脊髓液等、 组织样本、细胞培养物样本、法医样本、环境样本等。
[0017] 根据本发明使用可磁化珠粒，其优选是可磁化纳米珠。珠粒优选具有1-10000纳 米范围内的大小、特别优选为5-1000纳米并且最优选为10-100纳米。珠粒是可磁化的。优 选珠粒是顺磁性珠和/或超顺磁性珠。它们例如可由钴制成或含有钴。其它可能的材料是 铁或氧化铁（如磁铁矿或铁合金）。在一种优选实施方式中，珠粒是由磁铁矿制成或含有磁 铁矿的顺磁性和/或超顺磁性珠。已证明含有磁铁矿颗粒的聚合物珠粒尤为有利。有利的 是，使用具有高饱和磁化强度、如l-200emu/g、优选2-70emu/g或50-200emu/g的珠粒，以便 产生尽可能强的待检测信号。
[0018] 珠粒涂有结合分子，以便与分析物的存在和/或浓度相关地实现珠粒的交联或者 说聚合。
[0019] 在某些实施方式中，使用这样的结合分子，其构成分析物的特异性结合配偶体、即 与分析物发生特异性相互作用，如通过抗体/抗原结合、受体/配体结合或通过核酸杂交。 当分析物例如是抗体时，则用于检测的珠粒可涂有由抗体识别的抗原。另一方面，当分析物 是抗原时，则珠粒可涂有针对抗原的抗体或抗体片段。当分析物是核酸时，则珠粒可涂有与 分析物互补的核酸（或核酸类似物）。
[0020] 在另外的实施方式中，可使用这样的结合分子，其间接地、即通过非固定化的结合 配偶体与分析物特异性地结合。因此，"通用的"结合分子、如针对特定种类（如小鼠、大鼠 等）的抗体的恒定域的抗体可被固定化到珠粒上。然后将该特定种类的非固定化抗体用作 检测抗体，其可与分析物特异性地结合。
[0021] 在另外的实施方式中，珠粒也可涂有分析物本身或涂有分析物类似物，例如用于 竞争试验。
[0022] 在本发明中可使用唯一种类的珠粒、即涂有一种结合分子的唯一种类的珠粒，或 使用多种类的珠粒、即涂有不同结合分子的多个种类的珠粒。
[0023] 另外，也可在试验中加入非固定化的结合分子、如用于分析物的非固定化结合配 偶体、或珠粒之间的连接分子，所述连接分子与分析物和珠粒的结合竞争。
[0024] 可通过已知方法为珠粒涂覆结合分子、如通过吸附、例如在使用化学偶联试剂的 情况下的共价键、和/或例如通过生物素/链霉亲和素结合的高亲和力相互作用。
[0025] 在特定实施方式中，可优选为珠粒设置基底涂层、优选亲水性的基底涂层，以便减 小基于疏水和/或磁相互作用的非特异性自聚合。在另外的实施方案中，也可利用非特异 性聚合的效果来确定分析物的浓度。
[0026] 下面详细说明试验形式的不同实施方式。第一种实施方式涉及具有多个用于结合 分子的结合位点的分析物的检测、如抗体的检测。该实施方式在图1中示出。当C型分子 (分析物）具有多个用于A型分子（结合分子）的结合位点时，进行如下操作：为珠粒涂覆 A型分子。优选随后制备均匀的珠粒悬浮液。然后将珠粒和含有待检测浓度c的分析物C 的样本液体放入试验井中。C型分子结合到珠粒表面上的A型分子上。由于分析物C含有 多个用于A的结合位点，所以珠粒发生聚合。分析物C的浓度c越高，珠粒的聚合程度就越 尚。
[0027] 在另一种实施方式中采用这样的试验形式，其能够确定具有用于两种不同的结合 分子的结合位点的分析物。该实施方式在图2中示出。D型分子（分析物）具有用于A型结 合分子的一个或多个结合位点以及用于B型结合分子的一个或多个结合位点，因此部分珠 粒被涂上A型分子（="A型珠粒"）并且另一部分珠粒被涂上B型分子（="B型珠粒"）。 优选首先制备均匀的、包括A型和B型珠粒的珠粒悬浮液。在此之前已在A和D之间以及 B与D之间的结合亲和力方面优化两种珠粒类型的浓度。接着，将珠粒和包含待检测浓度c 的分析物D的样本液体放入在试验井中。D型分子结合到A型珠粒表面上的A型分子上及 B型珠粒表面上的B型分子上，由此珠粒发生交联或聚合。聚合程度越高，则分析物D的浓 度c就越大。
[0028] 根据本发明的另一种实施方式，当样本中存在待检测的分析物时抑制聚合体形 成。该实施方式在图3中示出。E型分子（分析物）具有一个或多个用于A型结合分子的 结合位点以及一个或多个用于B型结合分子的结合位点，在多于一个结合位点的情况下，E 与A的结合抑制E与B的结合并且E和B的结合抑制E与A的结合。在本实施例中使用的 一部分珠粒涂有A型分子并且另一部分珠粒涂有B型分子。优选首先制备均匀的、包括A 型和B型珠粒的珠粒悬浮液，有利的是在此之前可如上所述优化两种珠粒类型的浓度。随 后，将珠粒和包含待检测浓度c的分析物E的样本液体放入在试验井中。当没有连接分子 D时珠粒不发生交联或聚合。只有当存在D型连接分子时才能发生聚合。通过分析物E结 合到固定化到珠粒上的A或B型结合分子上，抑制珠粒聚合，因为用于D型连接分子的自由 结合位点较少。E的浓度越高，则珠粒的聚合程度就越低。
[0029] 在另一种实施方式中，分析物或分析物类似物可固定化到珠粒本身上。该实施方 式在图4中示出。在此情况下存在涂有结合分子A的珠粒和涂有分析物C或其类似物的珠 粒。优选首先制备均匀的、包括A型和C型珠粒的珠粒悬浮液，有利的是在此之前可优化两 种珠粒悬浮液的浓度。随后，优选将C型珠粒和包含待