一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选方法及筛选出的生物标记物的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物标记物的筛选领域，具体涉及一种弓形虫感染后血清中生物标记 物的筛选方法及筛选出的生物标记物的应用。
【背景技术】
[0002] 弓形虫（Toxoplasma,gondii)是一种顶复门原虫，广泛寄生于哺乳动物的有核细 胞内，包括人类。它是一种重要的人兽共患性寄生虫病病原，具有发病率高、危害严重的流 行病学特点。人类或动物因食入被包囊污染的肉制品或饮用被卵囊污染的水而发生感染。 不同人群在感染弓形虫后可能会出现不同的临床症状，并且弓形虫的种型也会对临床症状 的表现产生影响。
[0003] 迅速增殖的弓形虫速殖子会引起急性感染，但是很快会被宿主的免疫系统控制。 然后速殖子会转变成缓殖子，被包囊包裹，进入一种缓慢的增殖状态，持续存在于宿主的肌 肉和脑组织中。当宿主的免疫系统受到抑制，这种潜在的感染又会被重新激发，出现急性感 染症状。比如艾滋病人产生的弓形虫性脑炎就是一个典型的例子。以前的研究表明，二型 虫株感染小鼠3天后就可以在肺组织中检测出来；当到达10天的时候弓形虫含量发展为最 多，而此时也被认为是二型虫株引起的急性感染阶段；位于脑组织中的弓形虫会继续增加， 直到感染后21天，此时被认为是慢性感染的开始。此时其他器官的弓形虫已经开始减少， 甚至已经消失。同时有研究证明弓形虫进入宿主的中枢神经系统后可以对宿主的行为产生 影响，比如损害宿主的学习能力和记忆能力。尽管慢性弓形虫感染在免疫力强健的宿主中 不表现冥想的临床症状，但是有研究发现一些精神疾病依然与弓形虫的感染直接相关，比 如精神分裂症，情绪紊乱和自杀。目前人们还不清楚弓形虫引起的精神疾病的病理基础是 什么。
[0004] 代谢组学，作为一种系统生物学的研究方法，已经广泛应用于各种模式生物的研 究。另外，代谢组学在原虫研究中也取得了长足发展，并成为研究宿主与寄生虫互作的强大 工具。目前在代谢组学的研究中，核磁共振技术和色谱-质谱连用技术是应用最为广泛的 两种技术。核磁共振技术的主要优点包括：核磁共振没有偏向性，对所有化合物的灵敏度一 样；无损伤性，可以在接近生理条件下进行试验，所以其可以直接处理生物流体而不需额外 的样品准备；另外它产生的信号与化合物的丰度直接线性相关。但是核磁共振也具有一些 局限性，比如灵敏度低，易形成信号重叠；测量范围有限。
[0005] 代谢组学分析得到的数据十分丰富，并呈多维形式存在。为使数据易于可视化 分析，应用模式识别和多维统计分析挖掘其中存在的信息。目前，用于分析代谢组数据的 算法分为两类，分别是非监督方法和有监督方法。监督方法是用来探索完全未知的数据特 征的方法，对原始数据信息依据样本特征进行分类，把具有相似特征的目标数据进行同源 性归类，并以可视的形式展现出来。目前常用的非监督方法包括聚类分析和主成分分析 (principalcomponentanalysis，PCA)等。有监督方法是在已有的知识基础上建立的信 息组，并利用已经建立的信息组对未知数据进行辨识、归类和预测。常用的有监督方法包括 线性判别分析、偏最小二乘法-显著性分析（PLS-DA)和人工神经元网络（ANN)。
[0006] 代谢组学的分析离不开各种现存的数据库。与转录组和蛋白质组相比，代谢组数 据库还不完善，还处在不断健全的阶段。目前应用比较广泛的代谢组数据库包括：D0ME， MetaCyc,MMP，ArMet和KEGG。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种大规模筛选弓形虫感 染后血清中生物标记物的方法及筛选出的生物标记物的应用。
[0008] 色谱-质谱连用技术因为其具有较高的灵敏性和特异性而被广泛应用于代谢组 学的研究中。目前气相色谱-质谱连用和液相色谱-质谱连用是最常用的两种技术手段。 气质连用具有很好的分离效率和廉价的成本。但是该技术对样本的要求比较高，需要进行 衍生化处理。液质连用技术则不需要对样品进行衍生化处理，再加上该技术的选择性及灵 敏度都比较令人满意，所以其的应用在目前更为主流。
[0009] 液质连用技术的离子化方式有大气压电离（API)包括大气压电喷雾电离ESI、大 气压化学电离APCI、大气压光电离APPI)与基质辅助激光解吸电离。前者采用四级杆或离 子陷阱质量分析器，统称API-MS。后者常用飞行时间作为质量分析器，所构成的仪器成为基 质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-T0F-MS)。API-MS可以和液相色谱等分离手 段连用，扩展了应用范围。而MSALDI-T0F-MS又以测样速度快，操作简单著名。另外质谱仪 也可以串联的形式连用，比如三重四极杆质谱仪。另外根据实验人员个性化的需求，也可以 将不同类型的质谱分析器连用，比如四级杆飞行时间分析器与电场轨道阱分析器连用。
[0010] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种弓形虫感染后血清中生物标 记物的筛选方法，是采用液相色谱-四极杆质谱连用的方法，再通过多变量分析和热图聚 类分析，筛选出弓形虫感染后血清中生物标记物。
[0011] 进一步的，上述的一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选方法，所述生物标 记物为犬尿氨酸、甘油磷酸胆碱、五羟色胺、胆碱、N-乙酰-DL-色氨酸、延胡索酸、L-苯丙 氨酸、苹果酸、12S-羟基-9E-十八烯酸和胞苷。
[0012] 进一步的，上述的一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选方法，包括以下步 骤：
[0013] 1)建立小鼠感染模型；
[0014] 2)液相色谱-四极杆质谱连用上机处理；
[0015] 3)数据处理和分析；
[0016] 4)差异性代谢物及其结构鉴定；
[0017] 5)聚类分析和生物标记物的筛选。
[0018] 本发明的第二个目的是提供了上述的一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛 选方法筛选得到的生物标记物在制备弓形虫病靶向药物中的应用。
[0019] 本发明的有益效果为：本发明提供的一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选 方法及筛选出的生物标记物的应用，能够大规模、显著的区分感染状态和未感染状态，可作 为一种准确可靠的方法应用于弓形虫感染鉴别诊断，为弓形虫病的诊断及预防起到了做出 了贡献。
【附图说明】
[0020] 图1为小鼠感染模型病理切片图。
[0021] 其中，A为小鼠感染14天后出现的典型症状：a，血管套；b，胶质细胞结节。B为小 鼠感染21天出现的典型症状：a，包囊；b，五角星代表胶质细胞结节，两侧剪头为包囊。
[0022] 图2为总体分析（PCA)结果图。
[0023] 其中，A为ESI+模式下，B为ESI-模式下。
[0024] 图3为感染组与对照组组间分析（OPLS-DA)结果图。
[0025] 其中，A为7天感染组与7天对照组OPLS-DA分析结果，B为14天感染组与14天 对照组OPLS-DA分析结果，C为21天感染组与21天对照组OPLS-DA分析结果。a为ESI+ 模式，b为ESI-模式。
[0026] 图4为感染组组间分析（OPLS-DA)结果图。
[0027] 其中，A为14天感染组与7天感染组OPLS-DA分析结果，B为7天感染组与21天 感染组OPLS-DA分析结果，C为21天感染组与14天感染组OPLS-DA分析结果。a为ESI+ 模式，b为ESI-模式。
[0028] 图5为感染组与对照组间、感染组间的热图分析图。
[0029] 其中，A为根据7天感染组与7天对照组的差异代谢物所做热图，B为根据14天感 染组与7天感染组的差异代谢物所做热图，C为根据21天感染与7天感染的差异代谢物所 做热图。上述三图的差异代谢物均是在正离子模式下找出的。
[0030] 图6是信息分析流程图。
[0031] 图7是不同时期差异代谢物维恩图。
[0032] 其中，A为正离子模式下；B为负离子模式下。
[0033] 图8生物标记物ROC曲线图。
[0034] 其中，生物标记物依次分别为犬尿氨酸（Kynurenine)、甘油磷酸胆碱 (Glycerophosphocholine)、五轻色胺（Serotonin)、胆喊（Choline)、N-乙酰-DL-色氨酸 (N-Acetyl-DL-tryptophan)、延胡索酸（Fumaricacid)、L_ 苯丙氨酸（L-Phenylalanine)、 苹果酸（Malicacid)、胞苷（Cytidine)、12S-羟基-9E-十八稀酸HOME(12S-hydroxy-9E_o ctadecenoicacid)〇
【具体实施方式】
[0035] 实施例1 :
[0036] 本发明物料来源：
[0037] 雌性Balb/c鼠：8周龄左右，体重22±2g，购自兰州大学医学实验中心。
[0038] 弓形虫PRU株：中国农业科学院兰州兽医研究所寄生虫功能基因组学研究室保 存。
[0039] IOXPCRBuffer(Mg2+free)、MgCl2 (25mM)、dNTPMixture(2. 5mMeach)、 Ex-Taq(5