处理（4小时）改变830个基因，而在高流动条件 (l.OPa)下进行药物处理（4小时）改变1563个基因。用药物处理细胞20小时会对暴露于 流动的细胞产生更少数量的基因变化（见表2)。运些结果表明，流动暴露的水平（0,0.2化 或1.OPa)会响应于PI-103处理来改变内皮基因表达，并且表明细胞培养环境是实验设计 的一个本质方面。PI-103结果在静态培养的细胞和两种流动条件之间是高度分化的，运表 明基于静态培养的检验对于预测药物化合物将如何与活体相互作用是低效的。通过建立模 拟目标组织中的流动特性的基于流动的检验，可对早期药物实验提供更相关的生理环境。
[0100] 表 2 阳…。不同的煎切麻力条件巧药物暴露时间：^.间的基闲表武差择 阳 102]
[0103] a条件2指的是药物暴露时间 阳104] 实例3 W化]在流动横拟时帝白质种类的巧巧作用的巧别 阳106] 在静态条件（无流动）下，在涂有胶原质I的生长表面上培养人主动脉内皮细胞， 直到达到融合为止。然后，使细胞在1. 0化下暴露于流动室装置中的流体流动20小时，或 在相同的时间量内保持静态培养。在20小时的时间点，用憐酸盐缓冲盐水（PB巧充分冲洗 两组细胞，然后在室溫下用PBS中4%的P-甲醒固定20分钟。固定之后，在室溫下用PBS 中0. 1 %的TR口ON?X-100渗透细胞15分钟。一旦渗透，再次用PBS充分冲洗细胞，然后按 照OlinkBioscience公司（瑞典，乌普萨拉）的DUOLINK饭II套件的使用说明来进行 处理。DUOLINK液II套件基于被称为邻位连接检验的技术来识别蛋白质与蛋白质的相 互作用。在制造商对免疫巧光应用场合建议的稀度下，对Smad2和整合素连接激酶1 (ILK) 的目标种类使用原发性抗体。 阳107] 图11A至图11E提出了六（6)个共焦激光扫描显微板，每个条件对应^做个。图 11A和图11D示出了用DAPI着色的细胞核，图11B和图11E示出了DUOLINK??信号（指 示蛋白质与蛋白质的相互作用），图11C和图11F示出了合并的细胞核和DUOLINK?-信 号。如从图11A至图11F中显而易见的，静态培养的细胞本质上在Smad2与ILK之间未表 现出相互作用。然而，在1化下经历20小时流动刺激的细胞会在两种蛋白质之间表现出明 显的相互作用。
[0108] 运些实验证明了使用流动对静态检验来研究基于细胞的蛋白质的激活和相互作 用现象的能力，特别是当目标相互作用可能存在于体内时。另外，证明了将显微术用作流动 室实验的检验技术。虽然不希望被任何特殊的操作理论限制，但可能仅在静态培养的细胞 中进行运些实验，将可能观察不到Smad2与ILK之间的相互作用。 阳109]实例4 阳"〇]通过思微术原仿檢测《个巧化梳巧的帝白质
[01川图12提供了静态生长的人主动脉内皮细胞的示例性显微图像，对所有等级的Akt和F-actin使细胞着色。在运种实验中，研究了通过相对厚（1.2mm)的聚苯乙締基质检测 并区分多个巧光信号的能力。成像任务的完成证明了在从聚苯乙締和其他塑料材料制造的 流动室中执行光学检验的功用。重要地，使用=个具有不同的激励和发射特性的巧光体在 奥林己斯FV1000激光扫描共焦显微镜上连续成像，并重构成清晰的复合图像。每个单独流 道能够单独检查目标蛋白质/结构的表达特性。
[0112] 为了完成运个实验，在S(3)个T-25烧瓶中培养内皮细胞，直到与LonzaEGM-2 生长介质化onza公司，美国，新泽西州，艾伦代尔）融合为止，然后用5ml的PBS在室溫下 冲洗两次，并用2ml的含4%P-甲醒的PBS固定15分钟。固定之后，将细胞再冲洗两次， 然后在5ml的PBS中清洗5分钟。然后，在室溫下对细胞增加含0. 1%TR口ON?X-100的 PBS的溶液15分钟，并重复PBS冲洗/清洗步骤。然后，对细胞增加5ml的含5%兔血清的 PBS，并允许其在4°C下轻度振荡地闭塞6小时。在室溫下执行使用含3%的牛血清白蛋白 度SA)的PBS的第二闭塞步骤1小时，然后W1:500的稀度在含3%BSA的PBS的溶液中对 全部Akt(细胞信号传导技术公司，美国，马萨诸塞州，丹弗斯）增加原发性兔抗体。允许 原发性抗体在4°C下轻度振荡地培养一整夜。用含3 %BSA的PBS重复冲洗/清洗步骤，然 后，在室溫下用细胞培养与ALEXAFLUOR麼555 (生命技术公司，美国，加利福尼亚州，福 斯特城）共辆的二次抗体1小时。用PBS重复冲洗/清洗步骤，然后，在PBS中增加赫斯特 33258(生命技术公司，美国，加利福尼亚州，福斯特城）和标记FITC的鬼笔环肤（生命技术 公司，美国，加利福尼亚州，福斯特城）的溶液，其分别为lyg/ml。在室溫下用细胞培养运 些成分10分钟，然后重复冲洗/清洗步骤。对细胞增加新的2ml体积的PBS，使每个烧瓶在 奥林己斯FV1000显微镜上成像。
[011引扶鸣连例的讨论
[0114] 如本文阐述的，本公开的流动室和方法可用于对所培养的细胞和/或组织的生物 特征或者甚至隔离的生物上关注的分子（包括但不限于，核酸、肤、多肤、多糖等等）进行检 验。如本文使用的，短语"生物特征"指的是任何可能关注的和/或可能由不同流动条件改 变的生物分子的特征。在一些实施例中，生物特征包括在施加一个或多个不同流动条件之 前、之后和/或之中在所培养的细胞和/或组织中的一个或多个基因产物的生长速度、调亡 或死亡速度、形态和/或表达曲线。
[0115] 另外，本公开的流动室和方法可在网络分析中使用，W分析例如不同流动条件下 的基因表达和/或蛋白质数据，W及具有任何其他基因表达和/或来自由此得到的任何其 他源的蛋白质表达式数据的来自于其的相关数据，W识别可能包括在产生于设定流动室实 验和/或流动条件中的生理机能中的生物路径。运会是一项强大的可用于新型生物标记发 现和/或新型药祀发现的技术，该发现基于相对简单的使用本公开的流动室和/或方法的 流动实验。可W与上文在实例中描述的方式类似的方式来获得运些数据，例如通过在从流 动室培养/刺激的细胞提取的RNA上运行微阵列。运种分析可使用专用软件，并且在其他 可能的读出器中可与基因表达和/或蛋白质表达和/或憐酸化数据相关。
[0116]因此，在现有技术中无法获得本公开的流动室的特征，其支持基于流动的细胞检 验的手动和自动执行及分析。
[0117] 参考文献
[0118] 下文列出的所有参考文献W及本公开中引用的所有参考文献均通过引证结合于 此，运些文献包括但不限于所有专利、专利申请及其公开、科技期刊文章和数据库入口（例 如，GENBANK饭数据库入口和所有其中可获得的注释），运些文献对本文使用的方法、 技术和/或组成进行补充说明，且对运些方法、技术和/或组成提供背景或教导。
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