一种用流式细胞术鉴定蓝莓倍性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用流式细胞术鉴定植物倍性的方法，特别涉及一种用流式细胞术鉴定 蓝莓倍性的方法。
【背景技术】
[0002] 蓝莓（^Blueberry)，又名蓝衆果，多泛指杜鹊花科（Ericaceae)越桔属 (Vaccinium)可食用的有色浆果，其果实深蓝，口感细腻，果香怡人。研究表明，蓝莓具有抗 氧化、抗衰老、抗癌、预防心血管疾病、保护视力等功效，是美国农业部鉴定的40多种果蔬 中抗氧化能力最强的一种，被国际粮农组织列入五大健康食品之一。自1906年Coville博 士选育出第一个蓝莓优良品种后，世界蓝莓产业随新品种的不断推出和推广而迅猛发展。 目前，全球已有30多个国家开展了蓝莓的大面积种植。我国也于80年代初开始了蓝莓引 种工作，目前市场流通的蓝莓品种已超240种，且国内蓝莓种植面积直线上升。广阔的蓝莓 种苗需求及高额的利润回报诱发了国内蓝莓种苗市场的过速膨胀，混乱的市场秩序直接导 致了蓝莓种苗品种混乱、品质参差不齐。而蓝莓品种倍性差异较大，北高丛蓝莓、南高丛蓝 莓和半高丛蓝以4倍体居多，矮丛蓝莓多是2倍体，而兔眼蓝莓是6倍体。复杂的倍性关 系，混乱的种苗市场，在影响农户收入的同时，也对我国自主优质蓝莓品种的选育工作造成 了极大不便，因此有必要开发一种快速测定蓝莓倍性的方法，为蓝莓育种中适合的亲本的 选择提供依据。
[0003] 流式细胞术（flow cytometry，FCM)就是利用流式细胞仪对处于流液中各种焚光 标记的微粒进行多参数快速定性、定量分析，具有高效率、高精确度、高灵敏度、无破坏性等 优点。在植物学研究中，流式细胞术被广泛的用于检测植物细胞核DNA含量及其倍性分析， FCM已成功的用于苹果、草莓、猕猴桃、荔枝等植物的倍性鉴定研究中。选择合适的细胞核 分离缓冲液，制备优质的细胞核悬液是FCM测定植物倍性的关键。但不同植物的组织结构 和化学成分都差异较大，这使得细胞核分离缓冲液的效果也不尽相同，目前还没有一种普 遍适用的细胞核分离缓冲液，蓝莓品种倍性的FCM鉴定更是鲜有报道。此外，现行FCM方法 中，使用最多的荧光染料是碘化丙啶（propidium iodide，PI)，该染料能够嵌入双链DNA及 RNA的碱基对中与之结合，所以在染色前必需使用RNase A处理细胞，排除双链RNA对实验 的干扰，这极大的增加了实验复杂度，也导致了实验结果中碎片峰的增加。
【发明内容】
[0004] 为了弥补以上领域的不足，本发明提供一种用流式细胞术鉴定蓝莓倍性的方法。
[0005] 本发明所提供的用流式细胞术鉴定蓝莓倍性的方法，包括如下步骤：
[0006] (1)配制包含如下组分的细胞核分离缓冲液：200mM Tris、4mM MgCl2 · 6H20、体积 百分比为〇· 5% -2%的Triton Χ-100 ;50πιΜβ -巯基乙醇；5mg-5g/50ml聚乙烯吡咯烷酮； 30mM二硫苏糖醇；
[0007] (2)向每克蓝莓叶片样品中加入4-10ml所述步骤（1)配制的细胞核分离缓冲液；
[0008] (3)将所述步骤（2)中的蓝莓叶片切碎后，过滤，收集滤液；
[0009] (4)将所述步骤⑶的滤液离心，弃上清，加入所述步骤⑴配制的细胞核分离缓 冲液重悬沉淀物；
[0010] (5)加入4, 6-联脒-2-苯基吲噪，染色；
[0011] (6)用流式细胞仪进行检测。
[0012] 所述步骤（1)中所述细胞核分离缓冲液包含如下组分：200mM Tris、4mM MgCl2 · 6H20、体积百分比为 2%的 Triton Χ-100 ;50πιΜβ-疏基乙醇；5mg_5g/50ml 聚乙稀 吡咯烷酮；30mM二硫苏糖醇。
[0013] 优选地，所述步骤（1)中所述细胞核分离缓冲液包含如下组分：200mM Tris、4mM MgCl2 · 6H20、体积百分比为2%的Triton Χ-100 ;50πιΜβ -巯基乙醇；5g/50ml聚乙烯吡咯 烷酮；30mM二硫苏糖醇。
[0014] 所述步骤（1)中所述细胞核分离缓冲液的pH值为7. 5。
[0015] 所述方法还包括在所述步骤（4)重悬沉淀物之后进行静置裂解的步骤。
[0016] 所述步骤（2)中所述加入细胞核分离缓冲液为冰浴的细胞核分离缓冲液。
[0017] 所述步骤（3)中所述切碎是在冰上进行；所述过滤是用300目尼龙膜过滤。
[0018] 所述步骤（4)中所述离心是用5000rpm转速于4°C离心l_5min。
[0019] 所述步骤（5)中所述4, 6-联脒-2-苯基吲哚的浓度为lmg/ml，加入量为5 μ 1 ;所 述染色为冰上避光染色15min。
[0020] 所述步骤（6)中所述流式细胞仪需具备355nm激发波长。
[0021] 本发明提出了一种使用DAPI染色鉴定蓝莓倍性的流式细胞术检测方法，即采用 流式细胞仪的弧光灯激发DAPI，检测不同蓝莓样品中的荧光累积情况，并与同类型已知倍 性的蓝莓品种的荧光峰值进行比较，简便、快速、批量鉴定蓝莓倍性的检测方法。
【附图说明】
[0022] 图1为对照组细胞核分离缓冲液制备的样品获得的FCM荧光直方图；横坐标为 FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目。
[0023] 图2为1号、2号和3号细胞核分离缓冲液制备的样品经FCM获得的直方图；横坐 标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目。
[0024] 图3为以已知倍性的六倍体蓝莓品种'灿烂'为材料，使用表2中所示的1号细胞 核分离缓冲液测定的FCM实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到 的细胞数目。其中A为荧光峰图，a为log转化后的荧光峰图。
[0025] 图4为以'蓝丰'为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液测定的FCM实 验结果，横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目。
[0026] 图5为以'斯巴露'为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液测定的FCM 实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目；其中C为荧 光峰图，c为log转化后的荧光峰图。
[0027] 图6为以'黑珍珠'为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液测定的FCM 实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目；其中D为荧 光峰图，d为log转化后的荧光峰图。
[0028] 图7为以美国蔓越桔为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液测定的FCM 实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目；其中E为荧 光峰图，e为log转化后的荧光峰图。
[0029] 图8为以长白山野生蔓越桔为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液测 定的FCM实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目；其 中F为荧光峰图，f为log转化后的荧光峰图。
[0030] 图9为以长白山野生笃斯越桔为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液 测定的FCM实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目； 其中G为荧光峰图，g为log转化后的荧光峰图。
[0031] 图10为以大兴安岭野生笃斯越桔为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲 液测定的FCM实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数 目；其中H为荧光峰图，h为log转化后的荧光峰图。
[0032] 图11为以大兴安岭野生红豆越桔为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲 液测定的FCM实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数 目；其中I为荧光峰图，i为log转化后的荧光峰图。
【具体实施方式】
[0033] 仪器及试剂：MoFIotmXDP 流式细胞仪（Beckman Coulter)，Flow-check 焚光球 (Beckman Coulter?)，DAPI染料（Roche Diagnostics)，其余未特别标明的试剂都购自 Sigma-Aldrich 公司。
[0034] 实验材料：蓝莓叶片多呈不同程度的革质化，且富含原花青素、有机酸等多酚类物 质，故本研究选择具有典型特征的蓝莓品种叶片及我国储量极大的蓝莓野生种为材料，列 表1如下：
[0035] 表1本发明所使用的蓝莓材料
[0037] 以上实验材料中的'灿烂'、'斯巴露'、'蓝丰'、'黑珍珠'和美国蔓越桔均购自 大连大学现代农业研究中心蓝莓研究所；蔓越桔（长白山区野生种）、笃斯越桔（大兴安 岭区野生种）、笃斯越桔（长白山区野生种）和红豆越桔（大兴安岭区野生种）均由大 连大学现代农业研究中心蓝莓研究所提供，记载过这些材料的非专利文献是：顾姻，贺 善安，於虹，王传永，吴文龙（2001)蓝浆果与蔓越桔（第1版）.北京：中国农业出版 社·PP.25-33, 142-187。
[0038] 实施例1、用流式细胞术鉴定蓝莓倍性的方法
[0039] 1、配制细胞核分离缓冲液：
[0040] 称取 1211. 4mg Tris、40. 65mg MgCl2 · 6Η20、231· 3mg DTT，用少量蒸馏水分别 溶解后，混合，向混合液中加入5mg-5g PVP-40、175. 97 μ 1 β -巯基乙醇、125 μ I-Iml TritonX-100,混匀，用HCl调节pH至7. 5,并定容终体积至50ml，配好后冰浴，备用。
[0041] 本实施例所配制的细胞核分离缓冲液如表2所示：
[0042] 表2本实施例所配制的细胞核分离缓冲液
[0045] 备注：所有的试剂现配现用，配好后置于4°C冰箱预冷后备用。聚乙烯吡咯烷酮 (PVP-40)、二硫苏糖醇（DTT)。
[0046] 2、制备用于流式细胞仪检测的细胞核样品
[0047] (1)称量0· 2-0. 5g新鲜的蓝莓叶片置于平皿中（平皿置于冰上），加 2ml冰浴的 细胞核分离缓冲液；
[0048] (2)用锋利的双面刀快速地用力剁切叶片（尽量使叶片浸置于缓冲液中），将叶片 切碎至末状；
[0049] (3)将切碎后的组织及细胞核分离缓冲液一同转移到300目的尼龙膜上，收集滤 液到I. 5ml离心管中；
[0050] (4)再加 Iml细胞核分离缓冲液至平皿中剩下的残留叶片碎片中，冲洗碎片，并将 冲洗后的细胞核分离缓冲液也用300目尼龙膜过滤到I. 5ml离心管中；
[0051] (5)将所有的滤液用5000rpm转速，4°C离心l_5min ;
[0052] (6)弃上清，用Iml冰浴的细胞核分离缓冲液重悬沉淀物（沉淀物有时是白色 的）；
[0053] (7)将离心管插入冰上，革质化严重的材料可静置裂解1-2h(嫩叶静置15-30min 即可）；
[0054] (8)向离心管中加5 μ 1 4, 6-联脒-2-苯基B引哚 (4,6-diamidino_2-phenyiindole，DAPI)(浓度 lmg/ml